Video-Okulographie in Mäuse

1. Vorbereitung Die folgenden Versuche wurden in Übereinstimmung mit The Duch Ethikkommission für Tierversuche durchgeführt. Vorbereiten Mäuse für Video-EOG. Um die Augenbewegungen einer Maus zu messen, muss der Kopf der Maus, um immobilisiert werden. Daher wird ein Sockel Konstruktion auf dem Schädel der Maus (Abbildung 1). Betäuben die Maus durch eine Mischung von Isofluran (Isofluran 1-1,5%; Rhodia Organique Feine Ltd, Frankreich) und Sauerstoff in einer Gaskammer. Die übermäßige Gas gespült wird. Aufrechterhaltung der Narkose über Bugspitze. Bestätigen Narkosetiefe über eine Prise Zeh. Pflegen Sie die Körpertemperatur bei 37 ° C mit Hilfe eines anal Thermosensor und ein Heizkissen (FHC, Bowdoinham, ME). Schützen Sie die Augen durch Abdecken mit einer Augensalbe (duratears, Alcon, Belgien). Rasieren Sie den dorsalen kranialen Fell, und reinigen Sie den OP-Bereich mit einer Drehung der Macchia und Betadine oder Chlorhexidin-Lösung. Machen Sie eine mittlere Linie Einschnitt, den dorsalen kranialen Oberfläche des Schädels aussetzen. Machen die Oberfläche sauber und trocken sein. Einen Tropfen Phosphorsäure (Phosphorsäure-Ätzgel 37,5%; Kerr, CA) auf der dorsalen kranialen Oberfläche des Schädels von Bregma auf Lambda. Entfernen Sie das Ätzmittel nach 15 Sekunden und machen die kraniale Oberfläche mit Kochsalzlösung und wieder trocken zu reinigen. Tragen Sie oben auf dieser geätzten kranialen Oberfläche ein Tropfen OptiBond prime (Kerr, CA) und an der Luft trocknen Sie ihn für 30 Sekunden. Geben Sie einen Tropfen Klebstoff OptiBond (Kerr, CA) auf der Oberseite des OptiBond prime und heilen mit Licht für 1 Minute (Maxima 480 sichtbar Lichthärtegerät, Henry Schein, USA). Decken Sie die Klebeschicht mit einer dünnen Schicht von Charisma (Heraeus Kulzer, Deutschland). Einbetten zwei verbundenen Muttern (Durchmesser: 3 mm) in dem Verbund. Härten Sie die Composite danach mit Licht. Wenn nötig, gelten zusätzliche Schichten von Verbundwerkstoffen und heilt sie mit Licht. AnzeigeMinister Buprenorphin (0,015 mg / kg, sc) zur postoperativen Analgesie. Das Tier sollte wieder auf die Beine innerhalb von ca. 5 min. Lassen Sie die Maus, um im eigenen Käfig bei Raumtemperatur wieder für mindestens 3 Tage nach der Operation. Video-Setup für die EOG-Mäuse (Abbildung 2). Platzieren Sie die Maus in der Restrainer und fixieren den Kopf auf die Restrainer durch zwei Schrauben (Bild 1). Die Maus muss nicht sein narkotisierten für dieses Verfahren. Einstweilige Zeit sollte nicht länger als 1 Stunde / Tag. Montieren der Maus Kopf-Körper Verzögerer auf einem XY-Plattform, die wiederum auf dem Drehtisch (Durchmesser: 60 cm) angebracht ist. Mit Hilfe der XY-Plattform kann die Maus den Kopf über der Mitte der Drehscheibe platziert werden. Die Maus kann über die Nick-, Gier-und Roll-Achsen bewegt werden. Der Kopf der Maus in der richtigen Tonhöhe, Gier-und Rollwinkel durch Ausrichten des Auges mit dem visuellen Bild des Auges durch die iSCAN syste generiert platziertm. Alternativ kann der Sockel Konstruktion auf den Kopf der Maus in einem stereotaktischen Rahmen 11 angeordnet werden. Der Drehtisch ist mit einem AC-Servo-gesteuerten Motor (Harmonic-Drive-AG, Niederlande) und der Position des Drehtisches befestigt ist durch ein Potentiometer (Bourns inc.., CA), die an dem Drehtisch Achse überwacht. Ein zylindrischer umliegenden Bildschirm (Durchmesser: 63 cm, Höhe: 35 cm) mit einer zufälligen Punktmuster (jedes Element 2 °) deckt den Plattenteller; diese Trommel ist auch mit einem AC-Servo-gesteuerten Motor (Harmonic Drive AG, Niederlande) ausgestattet . Die Position der zylindrischen Abdeckung wird durch ein Potentiometer (Bourns inc.., CA), die an seine Achse und der Bildschirm durch eine Halogenlampe (20 Watt) beleuchtet werden überwacht. Sowohl die umliegenden Bildschirm und die Drehscheibe werden getrennt angetrieben. Die Bewegung des Drehtisches und Umgebung erfolgt über einen Computer, der mit einem I / O-Schnittstelle (CED begrenzt, Cambridge, Großbritannien) verbunden ist, gesteuert. TaBLE und den umliegenden Bildschirmposition Signale werden gefiltert (Cut-off-Frequenz: 20 Hz), digitalisiert durch die I / O-Schnittstelle und möchte auf diesem Computer gespeichert. Das Auge der Maus wird durch drei Infrarot-Strahlern beleuchtet (600 mW, Abstrahlwinkel: 7 °, Peakwellenlänge: 880 nm, RS Components, die Niederlande). Zwei Infrarot-Strahler mit dem Drehteller befestigt ist und der dritte Emitter mit der Kamera angebracht ist. Diese dritten Emitter erzeugt ein Referenz-Hornhautreflexion (CR), die während der Kalibrierung und während der Augenbewegung Aufnahmen verwendet wird. Ein Infrarot-CCD-Kamera mit Zoom-Objektiv (Zoom 6000, Navitar inc.., NY) ausgestattet ist, um dem Drehtisch befestigt und auf der Maus Kopf in der Mitte des Drehtisches konzentriert. Die Kamera kann verriegelt ist und damit über dem Plattenteller Achse nachgeführt werden über genau 20 ° während der Kalibrierung. Das Videosignal wird durch einen Eye Tracking System (ETL-200, iSCAN, Burlington, MA) verarbeitet. Der iScan-System verwendet einen AlgorithmusAlgorithmus, um die Zentren der Pupille und der Referenz CR verfolgen. Das System kann den Schüler-und Referenz-CR in horizontaler und vertikaler Richtung zu verfolgen mit einer Abtastrate von 120 Hz. Referenz CR Position Pupillenposition und Pupillengröße Signale werden durch die I / O-Schnittstelle digitalisiert und in der gleichen Datei wie die Tabelle und die umliegenden Bildschirmposition gespeicherten Signale. Die Video-Schüler-Tracking-System induziert eine Verzögerung der Augenbewegung Signalen von etwa 27 ms. 2. Kalibrieren und Messen Eye Movements Einsatz von Video-Tracking-Schüler Das Eye-Tracking-System erfasst die Bewegung der Pupille als eine Translationsbewegung. Die Translationsbewegung der Pupille erfasst enthält eine translatorische Komponente durch axiale Differenz zwischen dem Rotationszentrum des Auges und der anatomischen Zentrum des Auges und (dh der Mittellinie der Hornhautkrümmung) und eine Rotationskomponente durch die Winkeldrehung des Augapfels. Durch subtrahierenÝng die Referenz CR von der Pupille Bewegung / Position, wird die unerwünschte translatorische Komponente aus dem Signal entfernt, was in eine translatorische Bewegung, die nur aufgrund der Drehung des Augapfels. Obwohl sie oft sehr klein sind, diese Subtraktion eliminiert auch die Übersetzungen zwischen dem Kopf und der Kamera. Das restliche isoliert Translationsbewegung in die Winkeldrehung des Augapfels durch die folgende Kalibrierverfahren 8,12 umgewandelt. Diese Kalibrierung wurde vor jeder Augenbewegung Experiment durchgeführt. Stellen Sie die Maus Kopfposition der Kamera in der Weise, dass das Videobild der Pupille in der Mitte des Bildschirms befindet, und dass die Darstellung des Referenz-CR ist auf der vertikalen Mittellinie des Auges am besten direkt über der Pupille befindet. Minimieren der Bewegungen des Referenz-CR durch kantige Kamera Drehungen, die, indem die Mitte der Hornhautkrümmung über die Kamera / Tischachse erreicht werden kann. </ Li> Drehen der Kamera mehrmals um + / – 10 ° (dh 20 Grad von Spitze zu Spitze) um die vertikale Achse des Drehtellers. Verwenden der Positionen der nachverfolgten Pupille (P) und der Referenzspannung CR in den extremen Positionen der Kamera aufgezeichnet, um eine Drehung des Radius der Drehung der Pupille zu berechnen (Rp; Rp = Δ / sin (20 °), wo Δ = (CR -P), siehe Abbildung 3A). Aufgrund der Tatsache, dass die Rp-Wert auf der Pupille eine Größe abhängt, muss eine Pupillengröße Korrektur implementiert 12 (3B) werden. Wiederholen Sie Schritt 2,2 mehrmals unter verschiedenen Lichtverhältnissen (dh Manipulation der Pupillengröße; 3C), um die Pupillengröße bestimmen – Rp Beziehung und bilden ein RP Korrekturkurve (3D). Die Rp-Wert hängt auch von der vertikalen Augenposition. Wenn das Experiment wird vertikalen Augenbewegungen verursachen dann eine Korrektur der Kalibrierung für vertikale Augenpositionen ist sehr empfehlenswert13. Bestimmen der Winkelposition des Auges (E) durch Messung der Referenz-CR Position P-Stellung und die Pupillengröße. Der Verweis CR Position wird von der Pupillenposition Erzeugen eines translationalen freien Pupillenposition subtrahiert. Durch Messung der Pupillengröße die Rp-Wert kann aus der Rp Korrekturkurve extrahiert und E können unter Verwendung der folgenden Formel berechnet E = arcsin {(Δ1) / Rp} (4A, wo Δ1 = (P 2-P 1) und P 1 und P 2 werden durch Subtraktion des Referenzsignals CR korrigiert). Ein großes Repertoire an Plattenspieler und / oder Rotationen umliegenden Bildschirm kann nun verwendet, um den okulomotorischen System zu stimulieren. Um Video Okulographie im Dunkeln durchführen, muss die Maus mit einem Auge auf miotischen Droge, um die Pupillenerweiterung zu begrenzen und ermöglichen Tracking Schüler unter diesen Umständen vorbehandelt werden. In unseren Experimenten verwenden wir Pilocarpin (4%, Chauvin Laboratories, Frankreich) nach Pupillenerweiterung in begrenzendie Dunkelheit. 3. Datenanalyse Augenpositionen, Tisch-Positionen und die umliegenden Bildschirm Positionen sind alle in Winkelpositionen umgewandelt (siehe Abbildung 4B und Formel in Abschnitt 2.4). Eye-Signale werden für ihre Verzögerung von 27 ms induziert durch die Bildverarbeitung der Pupille-Tracking-System korrigiert. Winkelstellungen des Auges, Tisch und umliegenden Bildschirm sind differenziert und gefiltert mit einem Butterworth-Tiefpassfilter mit einer Grenzfrequenz von 20 Hz. Sakkaden sind aus dem Auge Geschwindigkeit unter Verwendung eines Nachweisgrenze von 40 ° / s entfernt. Die Daten entfernt ab 20 ms vor und bis zu 80 ms nach dem Überqueren der Nachweisgrenze. Tabelle, um Bildschirm und Auge Geschwindigkeitssignale werden gemittelt über jeden einzelnen Zyklus in der Spur (4C). Gemittelten Signale werden mit einer entsprechenden Funktion ausgestattet. Im Allgemeinen wird eine sinusförmige Geschwindigkeit Stimulation und die gemittelteZyklen werden mit Sinus-oder Cosinus-Funktion (4C) ausgestattet. Dann kann die Verstärkung als das Verhältnis der Augen der Stimulusgeschwindigkeit Geschwindigkeit berechnet werden, während die Phase als die Differenz (in Grad) zwischen dem Auge Geschwindigkeit und Stimulusgeschwindigkeit berechnet werden kann. 4. Repräsentative Ergebnisse Video-Okulographie kann verwendet werden, um verschiedene Formen der okulomotorischen Aufführungen (dh optokinetischen Reflex: OKR; vestibulo-okulären Reflexes: VOR; visuell verbesserte vestibulo-okulären Reflexes: VVOR) zu untersuchen sowie motorischen Lernens (VOR Anpassung; OKR Adaptation). Der OKR kompensiert tieffrequente Störungen mit visuellem Feedback. Der OKR kann durch Drehen des gut ausgeleuchteten Umgebung Bildschirm (Movie 1) induziert werden. Drehen des umgebenden Schirm über einem Frequenzbereich von 0,2 -1,0 Hz bei einer Amplitude von 1,6 ° zeigt, wie die optokinetischen System eine effizientere Ausgleichsmechanismus im niederfrequenten Bereich tha istn im Hochfrequenzbereich (5A). Die VOR kompensiert hochfrequenten Kopfbewegungen über Signale aus den vestibulären Organe. Die VOR kann durch Drehen des Tieres (zB Plattenspieler) im Dunkeln (Film 2) induziert werden. Drehen des Drehtisches über einen Frequenzbereich von 0,2 -1,0 Hz bei einer Amplitude von 1,6 ° zeigt, wie die vestibulookulären effizienter bei der Erzeugung Kompensieren Augenbewegungen in der Hochfrequenz-Bereich als im niederfrequenten Bereich (5A) . Wenn die optokinetischen und vestibulo-okulären System an einem Strang, können Bilder auf der Netzhaut über einen weiten Bereich von Kopfbewegungen stabilisiert werden. Drehen der Drehscheibe über einen Frequenzbereich von 0,2 -1,0 Hz mit einer Amplitude von 1,6 °, während das umgebende Bildschirm ist gut ausgeleuchtet (Film 3) zeigt, wie das Auge "High Gain" Ausgleichsbewegungen über den gesamten Frequenzbereich (5A erzeugt ). Alle diese Gewinn-und pH-ASE-Werte sind typisch für Mäuse, obwohl Gender-14 und Dehnung 15,16,17 Unterschiede gemeldet wurden. Die unabhängige Kontrolle über die Drehscheibe und die umliegende Bildschirm ermöglicht uns, die Mäuse mit einem Missverhältnis zwischen visueller und vestibulärer Informationen zu konfrontieren. Nach einer langfristigen und gleichmäßige Belichtung von nicht übereinstimmenden visuellen und vestibulären Informationen wird die VOR der Maus ändern, um für die veränderten visuellen Input (VOR Anpassung; Movie 4) zu kompensieren. Drehen der Drehscheibe aus der Phase (dh 180 °) mit dem umgebenden Bildschirm (1 Hz, 1,6 °) erhöht die VOR-Verstärkung (Abbildung 5B). Die maximale Veränderung der VOR-Verstärkung, bei der Verwendung eines ein Versuch Lernparadigma, wird oft nach 30 Minuten erreicht. Abbildung 1. Schematische Darstellung des Maus-Kopf-Körper zurückhält. Der Körper der Maus ist zurückhaltend mitein Kunststoff zylindrischen Rohr mit einem Durchmesser von 35 mm. Der Kopf der Maus wird durch Verbinden der Sockel der Maus an die Eisenstange mit zwei Schrauben fixiert. Die Eisenstange einen Winkel von 30 Grad um den Kopf der Maus in die normale Tonhöhe beim Gehen zu positionieren. * Draufsicht des Sockels mit zwei Muttern. Abbildung 2. Schematische Darstellung des Maus-Video-EOG-Setup. Abbildung 3. Kalibrierung des Video-Schüler-Tracking-System. A) Die Kamera ist mehrfach gedreht um + / – 10 ° (dh 20 Grad von Spitze zu Spitze) um die vertikale Achse des Drehtellers. Die nachverfolgte Pupille (P) und die Referenz Hornhautreflexion (CR) in den Endstellungen der Kameradreh aufgezeichnet werden verwendet, um den Radius der Drehung der Pupille zu berechnen(Rp). B) Der Radius der Pupille Durchmesser ist abhängig von der Größe der Pupille. C) Das Beispiel zeigt die Wirkung der Pupillengröße auf Pupillenposition während der Kalibrierprozedur (sowohl in Pixel (px gemessen)). D) Beziehung zwischen RP und Pupillendurchmesser in einem einzigen Maus gemessen. Die dreizehn verschiedene Pupillendurchmesser wurden durch Veränderung der Intensität des Umgebungslichts erreicht. Abbildung 4. Messung und Analyse der Augenbewegungen mit Hilfe von Video-Tracking-Schüler. Korrigiert CR-Position); A) Die Winkelposition Pupillenposition von Radius der Pupille (Rp) und der Position der Pupille (P berechnet. B) Beispiel für die kompensatorische Augenbewegung durch die Stimulierung der vestibulären und visuellen System (visuell verbesserte VOR) induziert. Die Drehscheibe gedreht wurde sinusförmig bei 0,6 Hz mit einer Amplitude von 1,6 °, während das umgebende Bildschirm war gut beleuchtet. C) Die Analysen der Aufzeichnunggezeigt in B). Das Diagramm zeigt die gemittelte Geschwindigkeit Spur des Drehtisches (blau) und Pupille (rot). Diese gemittelten Spuren wurden mit einer sinusförmigen Funktion (schwarz) angebracht ist. Abbildung 5. Leistung und Lernen des okulomotorischen System in einem C57Bl6 Maus gemessen. A) Augenbewegungen werden durch Drehungen des umgebenden Bildschirm (optokinetischen Reflex erzeugt: OKR, obere Bilder), durch Drehen der Maus in der Dunkelheit (vestibulo-okulären Reflexes: VOR-, Mittel-Platten) und durch Drehen der Maus im Licht (visuell -verstärkte vestibulo-okulären Reflexes: VVOR, unteres Feld) mit Frequenzen im Bereich 0,2 bis 1,0 Hz bei einer Amplitude von 1,6 °. Die Verstärkung des Reflexes wurde als das Verhältnis des Auges Geschwindigkeit der Stimulusgeschwindigkeit (linkes Bild) und die Phase des Reflexes berechnet wurde aus der Phasendifferenz zwischen dem Auge Geschwindigkeit und Stimulusgeschwindigkeit (rechte Felder) berechnet. B) Motorisches Lernen wurde erreicht durch adaptiv Erhöhung der VOR mit Hilfe eines aus der Phase Ausbildung Paradigma. Die Maus war Gegenstand einer visuovestibular Ausbildung Paradigma, in dem die Drehung der Maus war außer Phase (180 °) mit der Drehung des umgebenden Schirm (sowohl rotierende bei 1,0 Hz, 1,6 °) für 40 Minuten. Alle 10 Minuten wird das VOR getestet wurde (1,0 Hz, 1,6 °). In dieser Maus aus der Phase der Ausbildung erhöht die VOR Gewinn. Movie 1. Animation des Paradigma, das OKR induziert in Mäusen Klicken Sie hier, um Film anzusehen . Movie 2. Animation zeigt das Paradigma, dass VOR induziert bei Mäusen. Hier klicken, um Film anzusehen . Movie 3. Animation zeigt das Paradigma, dass VVOR in Mäusen induziert..com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um Film zu sehen. Movie 4. Animation des visuovestibular aus der Phase Ausbildung Paradigma, das VOR-Anpassung (Erhöhung) in Mäusen induziert. Hier klicken, um Film anzusehen .