Électrophorèse sur gel d'agarose pour la séparation de fragments d'ADN

Électrophorèse sur gel s'est avéré être un moyen efficient et efficace de séparation des acides nucléiques. La force d'agarose de gel élevée permet la manipulation de gels de pourcentage faible pour la séparation de fragments d'ADN de grande taille. Tamisage moléculaire est déterminé par la taille de pores générés par les faisceaux d'agarose ⁷ dans la matrice de gel. En général, plus la concentration d'agarose, le plus petit de la taille des pores. Traditionnelles des gels d'agarose sont les plus efficaces à la séparation de fragments d'ADN entre 100 pb et 25 ko. Pour séparer des fragments d'ADN de plus de 25 ko, on aura besoin d'utiliser électrophorèse en champ pulsé ^6, qui implique l'application d'un courant alternatif à partir de deux directions différentes. De cette façon, les grandes fragments d'ADN de taille sont séparés par la vitesse à laquelle ils se réorienter avec les changements de direction actuelle. Petits fragments d'ADN de 100 pb sont plus efficacement séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Contrairement àdes gels d'agarose, la matrice en gel de polyacrylamide est formé par une réaction chimique radicalaire libre entraîné. Ces gels sont plus minces de concentration plus élevée, sont exécutés à la verticale et ont une meilleure résolution. Dans l'ADN moderne séquençage électrophorèse capillaire est utilisé, lequel tubes capillaires sont remplis d'une matrice de gel. L'utilisation de tubes capillaires permet l'application de tensions élevées, ce qui permet la séparation des fragments d'ADN (et la détermination de la séquence d'ADN) rapidement.

Agarose peut être modifiée pour créer de fusion bas agarose par hydroxyéthylation. Bas point de fusion d'agarose est généralement utilisée lorsque l'isolement de fragments d'ADN séparés est souhaitée. Hydroxyéthylation réduit la densité de tassement des faisceaux d'agarose, de réduire efficacement la taille de pore ^8. Cela signifie qu'un fragment d'ADN de la même taille prendra plus de temps à se déplacer à travers un bas point de fusion gel d'agarose, par opposition à un gel d'agarose norme. Parce que les faisceaux de s'associer à un autrepar le biais des interactions non covalentes ^9, il est possible de faire fondre un gel d'agarose après qu'il s'est fixés.

EtBr est le réactif le plus couramment utilisé pour colorer l'ADN dans des gels d'agarose ^10. Lorsqu'ils sont exposés à la lumière UV, les électrons dans le noyau aromatique de la molécule d'éthidium sont activés, ce qui conduit à la libération de l'énergie (la lumière) que le retour des électrons à l'état fondamental. EtBr fonctionne par lui-même intercalant dans la molécule d'ADN d'une manière dépendante de la concentration. Cela permet une estimation de la quantité d'ADN dans une bande d'ADN notamment en fonction de son intensité. En raison de sa charge positive, l'utilisation de EtBr réduit le taux de migration de l'ADN de 15%. EtBr est un mutagène et cancérogène suspect, donc il faut faire preuve de prudence lors de la manipulation des gels d'agarose qui en contiennent. En outre, EtBr est considéré comme un déchet dangereux et doivent être éliminés de façon appropriée. Les taches de rechange pour l'ADN dans des gels d'agarose comprennent SYBR Gold, SYBR green, cristal violet et de bleu de méthylène. Parmi ceux-ci,Méthyl bleu violet cristallisé et ne nécessitent pas l'exposition du gel à une lumière UV pour la visualisation des bandes d'ADN, ce qui réduit la probabilité d'une mutation si le recouvrement du fragment d'ADN à partir du gel est souhaitée. Toutefois, leurs sensibilités sont plus bas que celui de EtBr. SYBR or et vert SYBR sont deux très sensibles, uv colorants dépendants avec moins de toxicité que EtBr, mais ils sont nettement plus chères. En outre, tous les colorants alternatifs soit ne peut pas être ou ne fonctionnent pas bien lorsqu'il est ajouté directement au gel, par conséquent, le gel devra être teinté poste après électrophorèse. En raison du coût, la facilité d'utilisation, et la sensibilité, EtBr reste le colorant de choix pour de nombreux chercheurs. Toutefois, dans certaines situations, comme lorsque l'élimination des déchets dangereux est difficile ou lorsque les élèves sont jeunes menant une expérience, un colorant moins toxique peut être préféré.

Colorants de chargement utilisées en électrophorèse sur gel répondent à trois objectifs principaux. D'abord, ils ajoutent la densité de l'échantillon, Ce qui lui permet de s'enfoncer dans le gel. Deuxièmement, les colorants donner de la couleur et de simplifier le processus de chargement. Enfin, les colorants se déplacer à taux standard à travers le gel, ce qui permet pour l'estimation de la distance que des fragments d'ADN ont migré.

Les dimensions exactes de fragments d'ADN séparés peuvent être déterminée en traçant le logarithme de la masse moléculaire pour les différentes bandes d'une norme d'ADN contre la distance parcourue par chaque bande. La norme d'ADN contient un mélange de fragments d'ADN de tailles prédéterminées qui peuvent être comparées aux échantillons d'ADN inconnus. Il est important de noter que les différentes formes de l'ADN se déplacer à travers le gel à des taux différents. ADN plasmidique surenroulé, en raison de sa conformation compacte, se déplace à travers la plus rapide de gel, suivie par un fragment d'ADN linéaire de la même taille, la forme circulaire ouverte déplacement le plus lent.

En conclusion, depuis l'adoption de gels d'agarose dans les années 1970 pour la séparation de l'ADN, il aavéré être l'une des techniques les plus utiles et polyvalent dans la recherche en sciences biologiques.