Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme
Summary
Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.
Abstract
Embriyonik spinal kord merkezi sinir sistemi (MSS) ve nöronal gliyal hücreleri büyük bir yüzdesi yol sinir hücrelerini progenitör bisiklet oluşur. Kadar moleküler mekanizmaları desen spinal kord hakkında bilinen ve nöronal farklılaşma 1, 2 ortaya çıkarmak olmasına rağmen, bu hücre davranış seviyesinde bu ilk etkinlik derin bir anlayış yoksundur. Onlar nörogenez geçerken, gerçek zamanlı olarak nöral progenitörlerin davranışlarını incelemek böylece önemlidir.
Erken embriyonik doku geçmişte, gerçek zamanlı görüntü hücre / doku kültüründe canlılığı gibi floresan görüntüleme fototoksik etkileri ile sınırlı kalmıştır. Burada yeni bir ex-vivo kesit kültürü protokolü ve geniş alan floresan mikroskobu (Şekil 1) kullanarak, uzun süreler için görüntüleme gibi doku için yeni bir test sunuyoruz. Bu yaklaşım civciv embriyonik s uzun vadeli time-lapse izleme ulaşıryüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip Pinal kablosu progenitör hücreler.
Bu testte geni faaliyeti için hücresel ve alt-hücresel davranışları, yeni bir gelişme ve çok hassas Muhabirlerin gözlem ek görüntü embriyonik dokular 3, 4, bir dizi ile değiştirilebilir (örneğin, Çentik sinyalleşme 5) Bu testte yapar sinyalizasyon nasıl anlamak için güçlü bir araç embriyonik gelişim sırasında hücre davranışı düzenler.
Protocol
Discussion
Biz tavuk embriyonik kesit kültürü hücre davranışlarını izlemek için buraya yeni bir time-lapse görüntüleme testi sunuyoruz. 24-48 saat arasında zaman kareleri yakalamak daha kolay olmasına rağmen Bu testte, 70 saate kadar canlı doku için yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Yüksek NA petrol objektif ve zaman noktaları arasında nispeten kısa aralıklarla kullanımı de bize genellikle hızlı gelişir hücre davranışlarını izlemek için izin olarak, yüksek çözünürlükte görüntü toplama sağlar, ve kolayca konfokal kullanarak geleneksel time-lapse görüntüleme sırasında atlanabilir mikroskopi.
Bu testin önemli avantajı uzun süreler boyunca görüntü hücrelere yeteneğidir. 7 mikroskobu konfokal lazer yerine geniş alan 6 kullanımı bunun için önemlidir. Konfokal mikroskop geleneksel optik kesitler alıp doğrudan odak bilgi dışarı ortadan kaldırmak için yeteneği de dahil, geniş alan mikroskopisi karşı çeşitli avantajlar sundu <sup> 7, ancak bir iğne deliği kullanımını önemli bir bilgi miktarı hariç, ve daha uzun maruz kalma süresi gerektiren, dedektör 8 ışık kaybına yol açmaktadır. Geniş alan mikroskopisi, diğer taraftan tam saha aydınlatma kullanan ve amacı ile, tüm geçen ışık dedektörü gönderilir. Bir yüksek kuantum verimliliği ile birleşince birleştiğinde cihaz (CCD) kamerası çok hızlı pozlama süreleri ile konfokal mikroskopi 9, göre gürültü oranı yüksek bir sinyal ile görüntüleme sağlar soğutulur. Bizim uygulama, biz uzun süre, kayıt 3D yığınları ve sonuçta küçük yakın kırınım sınırlı yapıları çözmek için görüntü gerekir. Konfokal mikroskopi hiç dedektör ulaşmasını out-of-focus ışığı engeller ve böylece önemli ölçüde kalın, yoğun-etiketli örnekleri 7, 8 arka plan azaltmakla birlikte, sadece çok daha fazla ışık girişi ile kullanılabilir bir sinyal-gürültü oranı elde geniş alan mikroskopisi 10. Çok ışığa duyarlı sparsel içinBizim electroporated omurilik dilimleri gibi y-etiketli örnekleri, bu nedenle, geniş alan mikroskopisi konfokal mikroskopi daha iyi yapar. Dekonvolüsyonun tarafından görüntü restorasyonu ile birlikte, hangi odak bilgi dışarı çıkarır ve geliştirir kontrast, geniş alan, küçük, loş nesnelerin 11 tespiti için özellikle iyi o olduğunu. Her doku görüntüleme deney için uygun olmasa da, bu yaklaşım bizim canlı hücre görüntüleme uygulaması için çok etkili olmuştur.
Floresan protein seçimi hücre yaşamını etkileyebilen önemli bir faktördür. Biz iyi sonuçları bir belirteç olarak yeşil floresan protein (GFP) 12 kullanımı yapıları elde görürüz. Şu anda etkin bir şekilde iki kanallı zaman ihmallerini GFP ile kombinasyon halinde de kullanılabilir kırmızı floresan proteinleri bir dizi değerlendirilmesi bulunmaktadır. 13 kullanılabilir Bu tür proteinleri bir dizi vardır. Birçok protein bir floresan protein füzyon olarak stabil olmasına rağmen, Bazı proteinler düşük hücre canlılığı ile sonuçlanan, füzyon ile kararsız kılınabilir. Bu gibi durumlarda, dahili bir ribozom giriş sitesi (IRES) içeren yapıları kullanımı flüoresan protein ilgili proteini ayırmak için yararlıdır.
Zaman görüntüleme spinal kord dilimleri, bakım floresan ışığına maruz kalma en aza indirmek için alınması gerekir. Mikroskop mercekleri dilimleri bulun ve pozisyona geçen ışık (aydınlık) ile kullanılabilir olmalıdır. Floresan resimler her zaman az pozlama süreleri kullanarak mikroskop yazılımı kullanılarak elde edilmelidir. Bunlar, 5-50 ms aralığında tutulması ve nötr yoğunluğu filtrelerin kullanımının deneyler edilmelidir. Uzun pozlama süreleri başlangıçta daha net görüntüler üretmek olsa da, floresan ışıkta fototoksik etkilerini hücre ölümüne yol açabilir. Bu bölgede sırasında zarar görmüş olabilen doku içerir coverslip en yakın olan doku ilk 5-10 mikron görüntülenmiştir edilmemelidirdilimleme.
Burada sunulan örnekler HH aşaması 10 ve daha sonra fazla görüntülü 6-7 saat electroporated embriyo olmakla birlikte, bu yöntem aşaması 18 HH embriyosu için kullanılabilmektedir. Daha sonraki aşamalarda, spinal kord doku çok daha büyük olduğu ve bu yüzden, elle dilim zordur. Bu durumlarda, düşük erime noktası agaroz içinde embriyo yerleştirilmesi ve bir vibratome ile kesit daha iyi sonuçlar verebilir. Biz gelişmekte olan omurilik görüntüleme hücreleri için bir yöntem olarak bu testte sunmak olsa da, bu yaklaşım aynı zamanda duyusal placodes 3 dahil olmak üzere görüntü diğer embriyonik dokular için modifiye edilmiştir.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| WillCo Dish | WillCo Wells | GWst-3522 | |
| poly-l-lysine | Sigma | P8970 | 0.1% in Tris |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Instruments | GC100-10 | 1.0mm outer diameter, 0.58mm inner diameter |
| Electrodes (Genetrodes, in ovo, L-shaped | BTX | 10-001850-01 | 5mm gold plated |
| ECM 830 square pulse generator | BTX | 45-0002 | for in ovo electroopration |
| Fast Green | Sigma | F7258 | |
| Type I rat collagen | Sigma | C3857 | |
| L-15 medium (powder) | Sigma | 2.76 g/L in distilled water for 5x solution |
|
| Sodium bicarbonate | Sigma | S8761 | 7.5% solution |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 12348-017 | without phenol red |
| Glutamax | Invitrogen | A1286001 | 100x solution |
| B-27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710049 | 10 mg/ml |
| L15 medium (liquid 1x) | Invitrogen | 11415-049 | |
| Microknife | Altomed | A10102 | 15 degree incline |
| Stainless steel headless pins | Watkins and Doncaster | E6871 | A1 size |
| Sylgard 184 elastomer | VWR | 634165S | |
| DeltaVision Core microscope system | Applied Precision | ||
| Coolsnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
Riferimenti
- Ulloa, F., Briscoe, J. Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord. Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).
- Briscoe, J., Novitch, B. G. Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).
- Shiau, C., Das, R., Storey, K. An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis. BMC Neuroscience. 12, 37 (2011).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis. BMC Biology. 9, 58 (2011).
- Herman, B. Fluorescence microscopy. Bios Scientific Publishers. , (1998).
- Conchello, J. -. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).
- Pawley, J. B., Pawley, J. B. . Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal. , (2006).
- Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).
- Biggs, D. S. C. 3D Deconvolution Microscopy. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges. IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).
