De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

1. Preparação prato Pratos utilizados para a cultura fatia são de vidro de fundo (com uma lamela como a base) (pratos WillCo). Estes são colocados sobre o tecido da lente em um prato de 6 centímetros de cultura de tecidos para manter o fundo de vidro limpo. No dia antes da experiência, adicionar 2 ml 0,1% de solução de poli-L-lisina para o prato de vidro de fundo e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para permitir que o poli-L-lisina revestir o fundo de vidro. Remover a poli-L-lisina solução e lavar três vezes em água desionizada, e depois uma vez em etanol a 70%. Deixar a secar durante a noite. Pratos podem também ser secos por aquecimento suave num microondas em baixa potência durante 30-45 segundos. 2. Eletroporação embrião Incubar ovos a 37 ° C a Hamburger-Hamilton (HH) estágio 10 (~ 36 horas) (ou fase desejada outro). Antes de começar preparar as agulhas de vidro (utilizamos uma flamejante / Brown modelo P87 extrator microcapilar) e quebrar a ponta da needle utilizando um fórceps finos sob um microscópio de dissecação. A extremidade da agulha deve ser afiado o suficiente para perfurar o embrião, embora não sendo tão estreita que impede a injecção da solução de ADN. Ovos de janela e eléctrodos lugar (5 milímetros de intervalo) em ambos os lados do embrião Injectar DNA (~ 0,025-0,5 mg / ul em água desionizada colorido com uma pequena quantidade de verde rápido) para dentro do tubo neural. Aplicar atual – 12-17 V três vezes, o comprimento do pulso de 50ms com 950 ms entre os pulsos. Usamos baixas concentrações de DNA e tensões eletroporação baixos para alcançar expressão mosaico para que possamos seguir células individuais. Cubra janela na casca do ovo com durex e verifique se ele está selado. Permitir que os embriões para recuperar durante 3-4 horas ou durante a noite a 37 ° C. 3. Colágeno e Slice Preparação Meio de Cultura Preparar a mistura de colágeno e meio de cultura fatia cerca de uma hora antes de fatiar. Para 300 t uLipo colagénio 1 adicionar 100 uL de solução de ácido acético a 0,1% e 100 uL de 5 x meio L15. Vortex bem após cada adição. A solução deve virar amarelo. Agora adicionar bicarbonato de sódio 15-20 ul de 7,5% e completamente vórtice. A solução deve tornar-se ligeiramente cor de rosa, eo volume de bicarbonato de sódio necessária para este pode diferir. Manter em gelo e fazer-se fresco a cada vez. A 10 ml de meio neurobasal adicionar B-27 e suplemento Glutamax, para uma concentração de 1 x 10 solução final e gentamicina uL. Médio lugar numa incubadora a 37 ° C tamponada com 5% de CO 2. Deixar a parte superior do recipiente para permitir que ele solto para equilibrar com a 2 CO. 4. Cultura Slice Remover embriões de ovos e lave em meio L15. Colocar em um prato de cultura de tecidos com uma camada de Sylgard na parte inferior e fixá-los para fora através das vizinhas membranas extra-embrionárias de modo que eles são esticada. Usando um microfoneroknife, embrião fatia mais reto possível através da região de interesse. Para medula espinal, as fatias deve estar entre 1-2 sómitos de espessura. Deixe fatias ligados ao embrião, enquanto você corta outros embriões que você não perdê-los. Prepara-se uma ponta 200 uL micropipeta cortando ~ 1 mm da ponta e anexando presente a um p2 ou p10. Esta ponta vai ser usado para transferir as fatias da medula espinal ao prato fundo de vidro. Uma dica 10 ul não é ampla o suficiente para pegar fatias. Revestir o interior da ponta com colagénio por pipetagem de 1 uL de colagénio mistura preparada anteriormente. Deixe por 1-2 minutos e depois lave com L15 médio. Isto impedirá que o tecido de furar para o interior da ponta. Destaque fatia do embrião usando um microlanceta e retire do prato usando um p2 ou p10 equipado com uma ponta de 200 ul e definido para 1 ml. Tente tomar-se como meio mínimo possível. Agitar a mistura de colagénio e gota 5-8 uL desta para o prato de poli-L-lisina revestido. Immediadamente colocar fatia embrião em colágeno e posição no lugar com um par de pinças finas. Fatias devem ser posicionado de modo que o lado a ser trabalhada é nivelada com a lamela. O tecido deve aderir o revestimento de poli-L-lisina sobre a lamela. Repita este procedimento até ter várias fatias na lamela. Em geral podemos colocar 6-9 fatias em um prato. Uma vez que todas as fatias estão no lugar, cobrir o prato e permitir que o colagénio para definir durante 20 minutos. Alguns dos primeiros colocados do colágeno pode já ter começado a secar. Para evitar este adicionar uma pequena quantidade de L15 a estes antes de cobertura. Uma vez ajustado, cuidadosamente adicionar meio de cultura 2ml fatia que tem sido equilibrada em CO2 a 5% a 37 ° C durante pelo menos uma hora. Cuidados devem ser tomados para não desalojar o colágeno da lamela. Colocar em um 37 ° / 5% de CO 2 incubadora e permitir que as fatias para recuperar durante pelo menos 3 horas antes de imagem. Se não houver umidade prato, colocar em uma sagacidade caixa de acrílicoha pouco de papel de filtro humedecido em um canto. 5. Embrião Fatias de imagem Nós usamos um Core DeltaVision microscópio de campo amplo equipado com uma câmara EstaçãoMeteorológica ambiental para fatias de imagem. A câmara é constantemente mantido a 37 ° C, com um aparelho de perfusão CO 2 para manter a fase microscópio em 5% de CO 2 / ar de 95%. Imagens é normalmente levada a cabo usando um 40 x / 1,30 NA lente de imersão em óleo e as imagens são capturadas com um HQ2 CoolSnap arrefecida câmara CCD. Z-seções são capturadas a cada 1,5 mM por 45 mM de tecido. Tempo de exposição deve ser mantida tão baixa quanto possível. Nós normalmente expor para 5-50 ms para cada Z-seção. As imagens são capturadas a cada 7 minutos e até 9 fatias pode ser visitada usando ponto preciso do sistema DeltaVision de visitar função. 6. Os resultados representativos Um exemplo de seqüência de lapso de tempo de uma célula da medula espinhal progenitor émostrado na fig. 2a e filme correspondente 1. Imagem foi iniciado em uma fatia da medula espinhal de um dois dias de idade embrião (HH estádio 12). Esta célula foi transfectada com um construto expressando GFP αTubulin. Durante esta fase inicial, as células progenitoras neurais sofrer divisões predominantemente progenitora progenitoras de modo durante o qual as células se dividem para gerar duas células progenitoras mais ciclismo. Fig. Filme 2b e correspondente 2 mostra uma célula transfectada com GFP-GPI (GPI ancorada GFP), a marcação da membrana celular. Esta célula sofre uma divisão durante o qual o processo se divide em dois basal e é igualmente herdado pelas células filhas. Figura 1. Protocolo Slice para cultura de lapso de tempo de imagem. Figura 2. B célulaehavior durante o desenvolvimento normal de medula espinhal. (a) quadros selecionados de Movie 1. Celular expressando GFP-tubulina divide com um plano de clivagem que é perpendicular à superfície apical (2 h 20 min), gerando duas células filhas que dividem mais uma vez (24 h 23 min e 25 h 54 min). (B) os quadros selecionados do filme 2. Células transfectadas com GFP-GPI sofre a divisão celular durante o qual o processo é dividido basal (setas brancas) e igualmente herdado pelas células filhas. Filme 1. Clique aqui para ver filme . Filme 2. Clique aqui para ver filme .