Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

1. Dish Vorbereitung Geschirr für Stück Kultur verwendet werden, sind mit Glasboden (mit einem Deckglas als Basis) (Willco Gerichte). Diese basieren auf Linsengewebe in einer 6 cm Gewebekulturschale zu halten Glasboden sauber platziert. Am Tag vor dem Experiment, 2 ml 0,1% Poly-L-Lysin-Lösung für den Glasboden Schüssel und Inkubation für 5min bei Raumtemperatur, damit das Poly-L-Lysin zur Beschichtung der Glasboden. Entfernen Poly-L-Lysin-Lösung und spülen Sie drei Mal in vollentsalztem Wasser, und dann noch einmal in 70% Ethanol. Lassen Sie über Nacht trocknen. Geschirr kann auch durch leichtes Erwärmen in der Mikrowelle bei niedriger Leistung für 30-45 Sekunden getrocknet werden. 2. Embryo Elektroporation Eier inkubieren bei 37 ° C zu Hamburger-Hamilton (HH) Stufe 10 (~ 36 Stunden) (oder einem anderen gewünschten Stufe). Vor Beginn der Vorbereitung Glasnadeln (wir verwenden eine Flaming / Brown-Modell p87 Mikrokapillare Abzieher) und brechen Sie die Spitze des needle mit einer feinen Pinzette unter einem Binokular. Das Ende der Nadel sollte scharf genug zu durchbohren der Embryo zwar nicht so eng, dass es der Injektion des DNA-Lösung behindert. Fenster Eier und Ort Elektroden (5mm Abstand) auf beiden Seiten des Embryos Inject DNA (~ 0,025 bis 0,5 ug / ul in VE-Wasser mit einer geringen Menge schnell grün eingefärbt) in das Neuralrohr. Tragen Sie aktuelle – 12-17 V dreimal, 50ms Pulslänge mit 950 ms zwischen den Impulsen. Wir verwenden niedrigen Konzentrationen von DNA und niedrigen Spannungen an Elektroporation Mosaik Expression zu erreichen, so dass wir einzelnen Zellen zu folgen. Cover Fenster in der Eierschale mit Klebeband und sicherzustellen, dass es dicht ist. Erlauben Embryonen für 3-4 Stunden oder über Nacht bei 37 ° C erholen 3. Collagen und Slice-Kulturmedium Vorbereitung Bereiten Collagen-Mix und in Scheiben schneiden Kulturmedium etwa eine Stunde vor dem Schneiden. Zu 300 ul typ 1-Kollagen mit 100 ul 0,1% Essigsäure-Lösung und 100 ul 5 x L15 Medium. Vortex gründlich nach jeder Zugabe. Die Lösung sollte gelb werden. Fügen Sie nun 15-20 ul 7,5% Natriumbicarbonat und gründlich vortexen. Die Lösung sollte leicht rosa geworden, und das Volumen von Natriumbicarbonat dafür benötigten können abweichen. Halten Sie auf dem Eis und machen jedes Mal frisch. Zu 10 ml Neurobasalmedium hinzufügen B-27 Ergänzung und Glutamax, zu einem 1 x Endkonzentration und 10 ul Gentamicin-Lösung. Ort Medium in einem 37 ° C Inkubator gepuffert mit 5% CO 2. Lassen Sie die Oberseite des Behälters locker, damit es mit dem CO 2 ausgleichen. 4. Slice-Kultur Entfernen Embryonen aus Ei und waschen in L15 Medium. In eine Gewebekulturschale mit einer Schicht aus Sylgard an der Unterseite und stecken Sie sie durch die umliegenden extra-embryonalen Membranen, so dass sie straff gespannt sind. Mit einem Mikrofonroknife, Slice Embryo so gerade wie möglich durch Region von Interesse. Für die Wirbelsäule, sollte Scheiben zwischen 1-2 Somiten dick sein. Lassen Sie Scheiben, die an Embryo, während Sie andere Embryonen, so dass Sie nicht verlieren, sie zu schneiden. Bereiten Sie eine 200 pl Mikropipettenspitze durch Abschneiden ~ 1 mm von der Spitze und Anbringen dieser auf eine P2-oder P10. Dieser Tipp wird verwendet, um die Wirbelsäule Scheiben an den Glasboden Gericht übertragen werden. Ein 10 ul Spitze ist nicht breit genug, um abholen Scheiben schneiden. Bestreichen Sie die Innenseite der Spitze mit Kollagen durch Pipettieren 1 ul Collagen-Mix vorbereitet früher. Verlassen Sie für 1-2 Minuten und dann spülen mit L15 Medium. Dies wird das Gewebe Kleben an der Innenseite der Spitze zu verhindern. Nehmen Scheibe von Embryo mit Hilfe eines microknife und entfernen aus der Schale mit einem P2 oder P10 mit einer 200 ul Spitze versehen und auf 1 pl. Versuchen Sie, mit möglichst wenig Medium wie möglich. Vortex das Kollagen Mischung Drop 5-8 ul diese an das Poly-L-Lysin beschichtete Schale. ImmediaTely setzen Embryo Scheibe in Kollagen und Position in Stelle mit einer feinen Pinzette. Scheiben sollten so positioniert, dass die Seite, die abgebildet werden bündig mit dem Deckglas ist. Das Gewebe sollte der Poly-L-Lysin-Beschichtung auf dem Deckglas haften. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Sie einige Scheiben auf dem Deckglas zu haben. Wir können in der Regel 6-9 legen Scheiben auf einem Teller. Nachdem alle Scheiben vorhanden sind, decken Sie die Schüssel und lassen Sie das Kollagen zu 20 Minuten eingestellt. Einige der frühesten angeordnet Kollagen kann bereits begonnen haben zu trocknen. Um dies zu verhindern eine kleine Menge von L15, diese vor abdeckt. Einmal eingestellt, vorsichtig 2ml Scheibe Kulturmedium, das äquilibriert wurde in 5% CO 2 bei 37 ° C für mindestens eine Stunde. Es ist darauf zu verdrängen nicht das Kollagen aus dem Deckglas werden. Platz in einem 37 ° / 5% CO 2-Inkubator und erlauben Scheiben für mindestens 3 Stunden vor der Bildgebung zu erholen. Wenn es keine Feuchtigkeit, statt Schüssel in einer Plexiglas-Box Witzha bisschen feuchten Papiertüchern in einer Ecke. 5. Imaging Embryo Scheiben Wir verwenden eine DeltaVision Core-wide-field-Mikroskop mit einem WeatherStation Klimakammer zu Bildschnitten ausgestattet. Die Kammer wird konstant auf 37 ° C, mit einem CO 2-Perfusion Vorrichtung gehalten, um die Mikroskoptisch bei 5% CO 2/95% Luft zu halten. Imaging wird in der Regel mit einem 40-x / 1,30 NA Ölimmersionslinse und Bilder sind mit einem CoolSnap HQ2 eingefangen gekühlte CCD-Kamera durchgeführt. Z-Profile werden alle 1,5 um bis 45 um Gewebe eingefangen. Belichtungszeit sollte so niedrig wie möglich gehalten werden. Wir in der Regel für 5 bis 50 ms aussetzen für jeden Z-Abschnitt. Die Bilder werden alle 7 Minuten gefangen genommen und bis zu 9 Scheiben können besichtigt Verwendung des Systems DeltaVision genauen Punkt zu besuchen Funktion sein. 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel Zeitraffer-Sequenz des Rückenmarks Progenitorzellen istgezeigt in. 2a und entsprechenden Movie 1. Imaging wurde auf einer Rückenmark Slice aus einer zwei Tage alten (HH Stadium 12) Embryo begonnen. Diese Zelle wurde mit einem Konstrukt, die GFP-αTubulin transfiziert. Während dieser frühen Phase durchlaufen neuronale Vorläuferzellen überwiegend Vorläuferzellen-Vorläuferzellen Modus Divisionen, während der die Zellen sich teilen, um zwei weitere Rad-Vorläuferzellen zu erzeugen. Abb. 2b und entsprechende Film 2 zeigt eine Zelle mit GFP-GPI (GPI-verankerten GFP) transfiziert, Kennzeichnung der Zellmembran. Diese Zelle erfährt eine Spaltung, während der die basalen Prozess spaltet sich in zwei und sind zu gleichen Teilen an die Tochterzellen vererbt. Abbildung 1. Slice-Kultur-Protokoll für Zeitraffer-Bildgebung. Abbildung 2. Zelle behavior während der normalen Entwicklung des Rückenmarks. (a) ausgewählte Bilder aus Film 1. Zelle, die GFP-Tubulin unterteilt mit einer Schnittstelle Ebene, die senkrecht zu der apikalen Oberfläche (2 h 20 min), Erzeugen von zwei Tochterzellen, die wieder (24 h 23 min und 25 h 54 min) zu unterteilen. (B) ausgewählte Bilder aus Movie 2. Zelle mit GFP-GPI transfiziert erfährt die Zellteilung, während der die basalen Prozess aufgeteilt (weiße Pfeile) und wird zu gleichen Teilen von den Tochterzellen vererbt. Movie 1. Hier klicken, um Film anzusehen . Movie 2. Hier klicken, um Film anzusehen .