高分辨率实时成像发展中的神经上皮细胞的行为

1。菜的制备用于片文化的菜玻璃底船（作为基地盖玻片）（WillCo菜）。这些都是摆在镜头上组织了6厘米的组织培养皿，保持干净的玻璃底部。 在实验前的一天，加2毫升0.1％的聚-L-赖氨酸的解决方案，以平底的玻璃盘在室温下孵育5分钟，让聚-L-赖氨酸涂层的玻璃底部。 删除聚-L-赖氨酸的解决方案，并在去离子水冲洗三次，再一次在70％的乙醇。 离开干通宵。菜也可以干，轻轻在低功率微波加热30-45秒。 2。胚胎的电穿孔 37鸡蛋在孵化°C间汉堡 – 哈密尔顿（HH）阶段10（〜36小时）（或其他所需的阶段）。 开始之前准备玻璃针（我们使用火焰/布朗模型P87微毛细管拔），打破了尖端的needlE使用在解剖显微镜下细的镊子。针到底应该足够清晰地刺穿，而不是如此狭窄，阻碍DNA溶液注射的胚胎。 胚胎两侧的窗口鸡蛋和地方电极（5毫米外） 成神经管，注入的DNA（0.025 – 0.5微克/μL去离子水与少量的快速绿色着色）。 适用于电流 – V THREE 12-17倍，与脉冲之间的950毫秒，50毫秒脉冲长度。 我们使用低浓度的DNA和低电电压来实现马赛克，使我们可以按照单个细胞的表达。 覆盖在蛋壳的窗口cellotape，并确保它是密封的。 允许胚胎为3-4小时或隔夜恢复在37°C。 3。胶原蛋白和切片培养基制备前准备切片胶原蛋白组合和片约一个小时的培养基。 到300微升ţYPE 1胶原蛋白加入100微升0.1％乙酸溶液和100μL5×L15培养基。每次加入后彻底涡。该解决方案应该变黄。 现在加入15-20微升7.5％碳酸氢钠，彻底旋涡。解决方案应该成为略带粉色的，这需要碳酸氢钠量可能会有所不同。保持在冰上，并作出新的每一次。 到10毫升的Neurobasal培养基中添加的B-27补充和Glutamax的，1×终浓度为10μL庆大霉素溶液。 地方在37℃孵化介质缓冲5％的CO 2。离开容器的顶部松动，使其能够平衡的CO 2。 4。片文化从鸡蛋中取出胚胎和L15培养基洗。 在组织培养皿中，在底层和sylgard引脚通过周围的多余胚胎膜出来，使他们都拉直的地方。 使用一个麦克风roknife，通过地区的利益，尽可能地直片胚胎。脊髓，切片厚1-2体节之间。离开胚胎切片，当你切其他的胚胎，这样你就不会失去他们。 准备切断〜1毫米的小费和附加到P2或P10 200μL微量尖。这篇文章将被用来传输脊髓片玻璃底菜。 10μl的秘诀是不广泛，足以拿起片。 大衣内的胶原吸取1μL胶原混合，提前准备的一角。离开1-2分钟，然后用L15培养基冲洗。这将防止从坚持以尖端的内部组织。 分离使用microknife的胚胎切片和删除使用装有200μl的尖端，并设置为1μL的P2或P10的菜。尝试以尽可能少的介质。 涡胶原蛋白的结构和降5-8μL这对聚-L-赖氨酸涂层菜。 immediately到位胚胎切片一双细镊子将胶原蛋白和位置。片的位置应使成像的一面是用盖玻片冲洗。组织应坚持以聚-L-赖氨酸涂层盖玻片。 重复此盖玻片上，直到你有几片。我们通常可以把一盘6-9片。 一旦所有的片到位，盖菜，让胶原蛋白为20分钟。最早放置的胶原蛋白，有些人可能已经开始干涸。为了防止这种情况添加少量的L15这些前覆盖。 一旦设置，小心加入2ml片培养基一直平衡在37°C在5％CO 2，至少一个小时。必须小心，不要接触从盖玻片的胶原蛋白。 1 37°/ 5％CO2培养箱的地方，并允许片恢复至少3个小时前成像。如果是没有湿度，在有机玻璃盒子机智的地方菜公顷的湿纸巾位在一个角落里。 5。成像胚胎切片我们使用1 DeltaVision核心的宽视场显微镜与环境WeatherStation室安装图像片。室经常保持在37°C，与CO 2灌流装置维持在5％CO 2/95％空气显微镜阶段。 通常进行成像采​​用40×/ 1.30 NA油浸镜头和图像捕获与CoolSnap HQ2冷却CCD相机。 Z轴部分被捕获每1.5微米至45微米的组织。应保持尽可能低的曝光时间。我们通常会为每个Z-节公开为5-50毫秒。拍摄的图像，每7分钟，并使用该DeltaVision系统的精确点访问功能，可以参观到9片。 6。代表结果脊髓祖细胞的一个例子时间推移顺序是如图。 2a和相应的电影1。影像开始在为期两天的岁（时时阶段12）胚胎的脊髓切片。这种细胞转染与表达GFPαTubulin结构。在这个早期阶段，神经祖细胞经历主要是在此期间，细胞分裂产生两个进一步的循环内皮祖细胞的祖祖模式师图。 2b和相应的电影2显示了一个细胞转染绿色荧光蛋白，磷脂（GPI锚，GFP）标记细胞膜。这种细胞经过表决，在此期间，基底的过程分成两个子细胞同样继承。 图1。时间推移成像片文化协议。 图2。单元Behavior在正常脊髓开发。（一）选定的帧从电影1。 GFP-微管蛋白表达细胞分裂与切割面是垂直的根尖表面（2小时20分钟），产生两个子细胞再次分裂（24小时23分钟和25小时54分钟）。 （二）从电影2选定的帧。与GFP的GPI转染细胞进行细胞分裂期间，基底过程被分割（白色箭头）和同样由子细胞继承。 电影1。 点击这里观看电影 。 电影2： 点击这里观看电影 。