Nöromüsküler Elektriksel Stimülasyon tarafından Kas Eğitimi A Mürin Modeli

1. Elektrot Hazırlanması Vektör devre kartı bir 1 cm x 1 cm bölümü kesin. Dışında yaklaşık 3.5 mm aralıklı iğneli, bir başkan yardımcısı tutuş kullanarak 2 wirewrap pimleri stabilize. Pim çatallı uçları yukarı dönük olmalıdır. Kargaburnu pense kullanarak, yaklaşık yarım uzunluğu boyunca 90 ° açıyla iğne wirewrap bükün. Tel izolasyon sıyırma tarafından konektörler, kurşun bağlantısı yaklaşık 7 cm'lik bakır teller Açığa. Bir wirewrap pimlerin çatallı ucuna lehim bakır tel biri. Diğer wirewrap pin için lehim işlemi tekrarlayın. Izolasyon ve istikrarı sağlamak üzere bakır kablo ve altın iğneli arasındaki lehimli bağlantı az şirink tüplerde çekin. Lehimleme ucu kullanarak tüp ısıtın. Breadboard devre komşu açıklıklara wirewrap pinlerinin unsoldered ipuçları yerleştirin. Wirewrap pinleri birbirine paralel ve st olduğundan emin olunyönetim kurulu ile yerleştirildiğinde ipuçları aynı mesafede bulunan bu tür breadboard üzerinden ick. Net epoksi içinde iğne lehimli biter Embed. Epoksi yaklaşık 10 dakika boyunca kurumaya bırakınız, veya tamamen kuru kadar. Pimleri ve vektör devre tamamen kurşun teller için yapısal bütünlüğünü ve gerilimin azaltılmasını sağlamak amacıyla gömülü kadar epoksi uygulaması tekrarlayın. Altın iğne uçları ortaya çıkarmak için metal bir dosya kullanarak epoksi aşağı Kum. Kablolarının düzgün süreklilik var, iki kahramanın elektriksel kısa devre olmadığından emin olun ve bir multimetre kullanın Elektrot kadın 2 yönlü telli bağlayıcı (Pomona kablonuzla) için NMES cihazdan açar takın. 2. Hayvan Hazırlık Hayvanlar% 100 O 2 gaz% 2 isofluorane (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) ile inhalasyon yoluyla anestezi uygulanmıştır. Hayvan t boyunca anestezi kalmalıdırO oturumda NMES. Başlamadan önce NMES protokolü hayvan tam anestezi olmasını sağlamak için bir ayak tutam gerçekleştirin. Hayvan düzenli anestezi düzeyi yeterlidir sağlamak için uyarılara yanıt için kontrol edilmelidir. Gerektiğinde anestezi ayarlanması gerekmektedir. Uyarılmış bacak, solunum derinliği değişiklikler ve mukoza renk dışındaki Hareketi tüm anestezi derinliği izlemek için düzenli olarak değerlendirilmelidir. Lateral pozisyonda hayvan yerleştirin. İşlem sırasında kornea kurutma önlemek üzere gözlere oftalmik yağlayıcı. Tedavi edilecek bacak alanı Tıraş ve alkol ile silin. Su ile yıkayın, daha sonra% 3 çamaşır suyu ile elektrot silin. Elektrot uygulanacak sitesi üzerinden jel iletken bir katman uygulayın. Elektrot ve deri arasında akımı sağlamak için NMES protokolü boyunca gerektiği gibi yeniden uygulayın. Bir ısı lambası or dolaşan su örtüsü, normal çekirdek vücut aralıkları korumak için kullanılmalıdır. Not: Tüm prosedürleri incelenmiş ve onaylanmış Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından temin PHS ve AAALAC Int yapılmıştır. akredite programı ve tesisleri. 3. Uyarım Elektrot yerleşimi: Tibialis anterior ve ekstansör digitorum longus kas dahil olmak üzere ön kompartman kasları, uyarılması için, doğrudan peroneal sinirin distal dalı kapalı hayvanın derin fibula sinir üzerinde yüzey elektrodu yerleştirin ve sadece ön bulunur fibula başında. Stimülasyon tam ayak bileği dorsifleksiyon ve rakamlardan tam ekstansiyon elicits zaman ön kompartman kaslarının uyarılması için, elektrot yerleştirme doğrulanır. Diğer taraftan, dorsifleksiyon, basamaklı bir uzantısı yokluğunda göstermektedir ki, sadece ön tibialisrior kas uyarılmış edilmektedir. Bu tür bir hedef, kontraktil tepkisi çalışma tasarımına bağlı olarak, arzu edilebilir. Başlangıç ​​sırasında oluşan bir serbest hareket eden, konsantrik fazı, ~ 0.5 saniye: kas kasılması stimülasyon 2 evreye ayrılır. Bu ilk aşamasında, pençe maksimal dorsifleksiyon ve basamaklı uzantısı bir dinlenme pozisyonundan hareket. Stimülasyon ikinci aşaması sonu aralık dorsifleksiyon haneli uzantısı sürdürülebilir bir izometrik kasılma olduğunu. Uyarım parametreleri: Bu NMES modeli geleneksel NMES 2 kanal (bkz. Tablo) sağlayan 300 PV Empi işlevli elektroterapi cihazı kullanmaktadır. Bu modelde amaçları için, sadece 1 kanalı kullanılır. Kullanılan parametreler simetrik dalga, 150 ms'den bir darbe süresi ve 50Hz bir frekans içerir. Stimülasyon süresi 0.5 saniye rampa aşağı yukarı 0.5 saniye rampa ile, 5 saniye olarak ayarlanır. Bu, kas accli daha yavaş yavaş sağlayacakstimülasyon dostum. Mevcut protokolde, kasılmalar arasında zaman kapalı 10 saniye olarak ayarlandı, ancak bu istenilen etkiye bağlı olarak ayarlanabilir. Kez kapalı azalmış kas yorgunluğu daha hızlı başlamasına neden olacaktır. Bu stimülasyon parametreleri önemli iskelet kası hasarı 1, 15, 16 neden olmadan, nöromüsküler elektrik stimülasyonu kullanarak kas gücünü artırmak için tasarlanmış klinik protokollere dayalı idi. Fareler set arasında 5 dakikalık bir dinlenme ile, 10 kasılmaları iki set tamamlamak. Yetişkin hayvanlar için, NMES yoğunluğu tipik olarak 9 mA başlatılır. Bizim deneyim, bu uyarım hemen ardından gözle görülür bir yürüme bozukluğu yol açmaz maksimal başlangıç ​​yoğunluğuna yaklaşık değerlerdir. Müteakip NMES seans, yoğunluğu 1 mA tarafından hayvanlara 20 tam dorsiflexions tamamlamak için mümkün olan her seferinde artar. Stimülasyon protokolü ve Reco tamamlanmasını takibenÇok anestezi, hayvanlar genellikle normal bir yürüyüş ve duruş göstermek. Yürüme NMES programı süresince yerinde idi kalmalıdır. 4. Temsilcisi Sonuçlar Vahşi Tipi (B6/10), B6.SCID ve mdx / SCID fareleri: Bu makalede açıklanan NMES protokolü dahil olmak üzere birçok fare suşları, uygulamaya konmuştur. 3-5 ay içerisinde 4 hafta (20 seans) üzerinden yapılan NMES Temsilcisi sonuçları eski mdx / SCID sunulmaktadır. Hayvanlar insanca anestezi altında ise servikal dislokasyon ile ötenazi uygulandı. Tibialis anterior kas 2 metil-bütan sıvı azot içinde ön-soğutulur ve -80 ° C'de C hasat ve hemen donduruldu Seri kesitler (10 mikron) elde edilen ve slaytlar üzerine monte edildi. İstatistiksel analizler (SPSS v19.0 yazılım) standart istatistiksel yazılım paketleri kullanılarak yapıldı. İlk olarak, Levene testi olmadığını orada wa değerlendirmek için kullanılanVaryansların s eşitliği. Bağımsız örneklem t-testi sonra NMES ve Kontrol gruplar arasındaki farklılıkları araştırmak amacıyla yapıldı. Hematoksilen ve Eosin (H & E) lekeleri NMES protokolü distrofik kas artmış yaralanmaya neden olup olmayacağını araştırmak için yapıldı. Bir bölümüne seçildi ve resimler bir ışık mikroskobu (Nikon Eclipse E800; Nikon, Japonya) kullanılarak elde edilmiştir. Rejenerasyon indeksi anlamlı bir artış (merkezi çekirdekli liflerin sayısı vardı geliştirilmiş bir görüntü analiz yazılımı, Resim J. – elyaf ve merkezi çekirdeği olan liflerin sayısı toplam sayısı elle Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) kullanılarak sayıldı Şekil 1); / NMES sunulan hayvanlarda liflerin sayısı), kontroller olarak (p = 0,802 ile karşılaştırıldığında. Bu NMES uygulama distrofik hayvanlarda görülen dejenerasyonu-rejenerasyon kaskadı artmaz gösterdiğini ve bu nedenle olası değildirartmış bir kas yara endükledikten edilmesi. CD31 için immünofloresan boyama kas vaskülaritesi üzerine 4 haftalık NMES protokolü etkisini araştırmak amacıyla yapıldı. Kısaca, kas bölümleri formalin% 4 oranında sabit ve% 5 At Serumu (HS) ile bloke edildi. Kesitler, bir sıçan anti-fare primer antikor (% 5 HS 1:300 seyreltme) ile inkübe edildi ve bir 555-etiketli keçi anti-sıçan sekonder antikor (% 5 HS 1:300 seyreltme) ile muamele edildi. CD31 pozitif hücrelerinin toplam sayısını ölçmek için, bir bölüm seçilmiş ve floresan mikroskop (Nikon Eclipse E800, Japonya) ile fotoğraflandı. Kılcal damarların toplam sayısı elle Kuzey Eclipse Yazılım (Empix Imaging Inc) kullanılarak sayıldı. NMES protokol olarak iskelet kas anjiyogenez teşvik tarif belirten; kontroller (Şekil 2 p <0.01) ile karşılaştırıldığında NMES sunulan hayvanlarda CD31 pozitif hücrelerin sayısı önemli bir artış vardı. <strong> in situ kontraktil test sisteminde: dört haftalık bir NMES protokolü tamamlanmasından sonra, ön kompartman kas kasılma test in situ test cihazı (Model 809B, Aurora Scientific Inc, Kanada), uyarıcısı (Model 701C, Aurora Scientific Inc bir kullanılarak gerçekleştirildi , Kanada) ve kuvvet dönüştürücü (Aurora Scientific Inc, Kanada). Kısaca, anestezi hayvanların peroneal sinir diz lateralinde küçük bir kesi ile izole edildi. Fareler daha sonra bir platform üzerine yerleştirildi ve yatar test edilen ayak ayak levhasının üzerine yerleştirildi. Test için kullanılan bacak diz ve ayak üzerinde bez bant ile stabilize edildi. Kaslar derinin altına yerleştirilen bir kanca elektrotlar kullanılarak uyarıldı. Tetanik kas kasılması, 4 haftalık NMES protokolü kas yürürlükte gelişmelere neden olup olmayacağını araştırmak için 350ms için 150Hz frekansında test edildi. Sonuçlar ıslak kas ağırlığı normalize edildi. Tetan yılında yaklaşık% 30 artış olduaçıklanan protokol düşündüren denetimleri (p = 0.005) (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında NMES sunulan hayvanların ic kasılması, mdx / SCID hayvanlarda iskelet kas gücünü artırır. NMES 4 hafta sonra A) tedavi verilmeyen kontrol, B). Şekil distrofik 1 Hematoksilen & Eosin iskelet kas boyama (mdx) / bağışık yetmezliği olan farelere (4-5 ay) (10x büyütme). Şekil 2. Distrofik iskelet kası (mdx) / bağışık yetmezliği olan farelere (4-5 ay) (20x büyütme) A) tedavi edilmemiş kontrol iskelet kası vaskülarite bir göstergesi olarak CD31 immünofloresan (kırmızı), B) 4 hafta sonra NMES. Şekil 3. Kontraktil testiön kompartman kontrol kas ve 4 hafta süreyle NMES ile muamele edilen hayvanların. MNm = milli Newton metre. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .