の性的開発と子嚢胞子放電フザリウムgraminearum種</em

1。子のう殻を作り出す Fの肥沃なひずみで6.0 cmの直径のペトリ皿の中心接種ニンジン寒天10 graminearum種 （PH-1を推奨）。 場所は、室温（18-24℃）で明るい蛍光灯の下で料理を接種し、菌糸体は、ペトリ皿（3-5日）の外側の端に達するまで成長することができます。市販の家庭用蛍光灯では、子実体の形成と放出を刺激するために正常に動作します。 穏やかに滅菌爪楊枝で菌糸を削除します。 滅菌ガラス又は滅菌hockeystickガラスロッドの丸みを帯びた端と表面に1.0ミリリットル2.5パーセントのTween 60水溶液を配布しています。 光板を返します。プレートにパラフィルムを追加しないでください。 24時間後、プレートの表面は光沢のある外観を持つ必要があります。もし菌糸が再び表示され、スクレープ表面および再適用のTween-60ソリューションを提供します。 来週上の子の​​う殻の発達を観察します。の中間段階被子器の開発が静かにRNA抽出（ 図1）凍結寒天とフラッシュの表面をこすることによって収穫することができます。 成熟した胞子は7日からプレートの蓋に蓄積されます。当初はこれらの唯一の実体顕微鏡の下に表示されますが、9日目で、彼らは肉眼で見えるとなるように十分な密度に蓄積されているでしょう。 2。子嚢胞子の放出アッセイツイーン溶液の塗布後6日目に、木のボーラーで寒天の1 cmの直径の円を切り取る。また、メスは、同様のサイズのセグメントを削除するために使用することができます。円を半分にスライスして各半分はガラス顕微鏡スライド上に配置することができます。 オリエントは断片ので、子実体を含んでいる面がスライドの表面に垂直であり、胞子は、スライドの長さをダウンして起動されます。 照明の下で一晩湿度チャンバ内でスライドを配置します。胞子に蓄積されスライドと肉眼で見えるように翌朝（ 図2）。 必要に応じて蓄積された胞子は水でスライドをオフに洗浄し、定量化することができる。 潜在的な子嚢胞子の放電阻害剤は、アッセイの組み立て時の寒天ブロックの背面側にそれらを追加することによって測定することができる。排出を削減するいくつかのイオンチャネル阻害剤は、以前にこのテクニックを15に検定されています。 3。組換え子孫の世代 F.の2系統とニンジン寒天培地を接種することによりクロスを開始graminearum種 （1寄生虫の卵+一NIT-）、ペトリ皿の両側に接種ポイントを配置する。 一度菌糸が空中部分をこすり、表面を充填し、上記のようにトゥイーン-60ソリューションを適用しています。菌糸が満たすペトリ皿の側面に注意することはマーカーを使用しています。 光に文化を返し、子のう殻が開発されるまでインキュベートし、cirrhiがありました二つの文化の交点に沿って子のう殻から形成する銃。 解剖顕微鏡下では、ビューに二つの文化の交差点に沿って子のう殻をもたらす。虫ピンを使用して、滅菌し、滅菌水に浸し、ピンの先端で軽くこの縁に沿って子嚢胞子塊をタッチします。ピンの水分子嚢胞子塊がピンに固執することができるはずです。 胞子を洗い流すためのエッペンドルフチュー​​ブに200μlの滅菌水でその上に子嚢胞子塊のピンの先端をすすぎます。 炎ピンは、再びそれを湿らせて、別の子嚢胞子塊を選択します。 10から15 cirrhiを選んで、水の別のチューブにそれぞれを配置します。 サスペンドcirrhiを含む簡単にボルテックスチューブ。 9センチメートルペトリ皿の中MMTS媒体1上にピペットと場所で胞子懸濁液の60μlを削除します。滅菌したホッケーのスティックと広がった。残りの胞子懸濁液は最大1週間までは4℃で保存し、必要に応じてプレーティングすることができます。 インキュベーション3〜5日間室温でTE（光は必要ありません）非常に小さなコロニーが（ 図3）が表示されるまで。コロニー間の表現型の二種類が存在します。 NIT-コロニーは、NIT +のコロニーよりスパースな菌糸を持ちます。組換え子のう殻からCirrhiはほぼ等しい割合でコロニー表現型の両方が表示されます。その上、単一の表現型のコロニーでプレートを破棄します。時にはつ以上の表現型が他の要因の分離のために生じることに注意してください。 V8またはストレージ用のニンジン寒天培地にコロニーを移動します。正しい表現型を確認するために、ドックスのドックス寒天培地（NIT-株はツァペックのドックスに成長しません）上および塩素（NIT +株は塩素とPDAになることはありません0.5 M塩素酸カリウム）とPDA上のテストコロニー。希望する品質のためにこれらのコロニーを調べます。 4。代表的な結果子のう殻を作り出す目標は、芝生を持つことであるすべての菌糸または胞子明らかせずに子のう殻。文化の表面は黒いベルベット（ 図1）に似て表示されます。 Tweenの塗布後24時間で寒天の表面には若干の光沢を持つ必要があります。菌糸再度表示されている場合、プレートは被子器の開発を誘導するために十分なスクレイプされていない可能性があります。 子嚢胞子の放電常にあなたのアッセイで、野生型株から寒天のいくつかのブロックを提供します。それらが起動しない場合は、どちらかあなたの子のう殻は若すぎるか古すぎる。彼らは古すぎる場合には、多数の菌糸はそれを白っぽい色合いを与える文化の表面上に表示されます。これはそうでない場合、彼らは若すぎるかもしれませんし、このアッセイは、24時間で再び試行すべきである。時折、文化も放電しないし、実験が繰り返されなければなりません。あなたは適切な光条件下でアッセイを行うことを確認してください。 組換え後代<p class="jove_content">組換え子のう殻は、2つの系統間の交差点に沿って子のう殻の大部分を確認する必要があります。我々は通常のクロスから10 cirrhiを処理し、それらの少なくとも4-6組換えなければなりません。ごくまれに、突然変異が交配から歪みを防ぐことができます。両親のいずれかが異常増殖表現型を持つ場合、2つ以上の表現型はMMTS上のコロニーの間で存在する可能性があります。 図1ニンジン寒天培地上に被子器開発の段階。トゥイーンを適用した後、左、72時間。赤色顔料、表面に黒い粒のように見える非常に若い子のう殻に注意してください。右、144時間後、成熟した子のう殻で形成されています。両方の文化では表面的な菌糸体のほぼ完全な欠如に注意してください。 図2放電アッセイ。オレンジ色のニンジン寒天プラグイン指向のようにthaのです​​。強制的にその表面に成熟した子のう殻から排出されるトン胞子はスライドグラスの表面に蓄積することができます。 15時間の累積時間。 図3選択MMTS媒体上に寄生虫の卵+およびNIT-コロニーの間に成長の違い。 NIT-コロニーは（矢頭）小さくなります。寄生虫の卵+コロニー（矢印）が力強い成長を示しています。写真は7日後に撮影。