Seksuele ontwikkeling en Ascospore Lozing in Fusarium graminearum</em

1. Het produceren van Perithecia Center inoculatie wortel agar 10 in een 6,0 cm diam petrischaal met een vruchtbare stam van F. graminearum (aanbevolen PH-1). Plaats geënte schalen onder felle tl-verlichting bij kamertemperatuur (18-24 ° C) en laat ze groeien tot mycelium heeft bereikt de buitenste rand van de petrischaal (3-5 dagen). Commerciële huishoudelijke tl-lampen werken prima voor het stimuleren van vruchtlichaam vorming en afscheiding. Verwijder de antenne mycelia met een steriele tandenstoker. Verdeel 1,0 ml 2,5% Tween 60 aq aan de oppervlakte met een steriele glazen hockeystick of afgeronde einde van een steriele glazen staaf. Terug platen aan het licht. Voeg geen Parafilm aan platen. Na 24 uur dient het oppervlak van de platen hebben een glanzend uiterlijk. Als mycelia opnieuw verschijnt, schraap het oppervlak en breng Tween-60 oplossing. Let op de ontwikkeling van perithecia in de komende week. De stadia tijdens hetperithecium ontwikkeling kan worden geoogst door zachtjes te schrapen het oppervlak van de agar en flash bevroren RNA-extractie (figuur 1). Oudere sporen zullen zich ophopen op het deksel van de plaat op dag 7. In eerste instantie zullen deze alleen zichtbaar onder een stereomicroscoop, maar door dag 9, zullen ze hebben verzameld om een ​​voldoende dichtheid, zodat zij met het blote oog. 2. Ascospore Discharge Assay Op dag 6 na het aanbrengen van Tween oplossing, snijd een 1 cm diameter cirkel uit de agar met een houten boor. Als alternatief kan een scalpel worden gebruikt om een ​​vergelijkbare grootte segment verwijderen. De cirkel gesneden worden in half en elke halve op een microscoopglaasje. Plaats de stukken zodat het oppervlak met de vruchtlichamen loodrecht op het oppervlak van de schuif en de sporen afgevuurd de lengte van de schuif. Plaats de dia in een vochtige kamer 's nachts onder lampen. Sporen zullen zich ophopen opde dia en zichtbaar voor het blote oog de ​​volgende ochtend (figuur 2). Cumulatieve sporen kan worden gewassen van de dia met water en gekwantificeerd indien gewenst. Mogelijke ascospore afvoer remmers kan worden getest door ze aan de achterzijde van de agar blok tijdens montage van de test. Sommige ionkanaal-remmers die de lozingen te beperken zijn eerder getest met deze techniek 15. 3. Generatie van Recombinant Progeny Start over te steken door het enten wortel agar met twee stammen van F. graminearum (een Nit + en een neet-), waarbij de inoculatie punten aan weerszijden van de petrischaal. Zodra hyfen hebben het oppervlak gevuld afschrapen antenne gedeelte en toepassing Tween-60 oplossing zoals hierboven beschreven. Gebruik marker vast aan de zijde van de petrischaal waar de hyfen voldoen. Keer terug culturen aan het licht en incubeer tot perithecia hebben ontwikkeld, en cirrhi hebben zijnpistool te vormen van de perithecia langs de kruising tussen de twee culturen. Onder de microscoop ontleden, te brengen in de perithecia te bekijken langs de kruising van de twee culturen. Met behulp van een insect pin, gesteriliseerd en gedompeld in steriel water, een cirrhus lichtjes aan te raken langs deze grens met de punt van de pen. Het vocht op de pin moet het mogelijk maken de cirrhus vast te houden aan de pin. Spoel het uiteinde van de pen met cirrhus op het in 200 pi steriel water in een eppendorfbuisje de sporen wassen. Verhit de pin, opnieuw bevochtigen en kies een andere cirrhus. Extra 10-15 cirrhi en plaats elk in een afzonderlijke buis water. In het kort vortexbuizen met zwevende cirrhi. Verwijder 60 pi van de sporesuspensie met een pipet plaats op MMT medium een in een 9cm petrischaal. Verdeel met een steriel hockeystick. De resterende sporensuspensie worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een week en opnieuw geplaat indien nodig. Incubatorte bij kamertemperatuur (licht niet noodzakelijk) gedurende 3-5 dagen tot zeer kleine kolonies verschijnen (figuur 3). Er zullen twee soorten fenotypes bij de kolonies. De NIT-koloniën zullen schaarser hyfen dan de Nit + koloniën. Cirrhi van recombinante perithecia zal zowel kolonie fenotypes in ongeveer gelijke verhouding. Gooi de platen met kolonies slechts een fenotype daarop. Merk op dat soms meer dan twee fenotypes leiden door segregatie van andere factoren. Ga kolonies op V8 of wortel agar voor opslag. Test kolonies op Dox Agar Czapek (de NIT-stammen zullen niet groeien op Czapek's Dox) en op de pda met Chloraat (0,5 M Kalium Chloraat, de Nit + stammen zullen niet groeien op de pda met Chloraat) om de juiste fenotype te bevestigen. Controleer deze kolonies voor de gewenste kwaliteiten. 4. Representatieve resultaten Het produceren van perithecia Het doel is om een ​​gazon vanperithecia zonder mycelia of sporen duidelijk. Het oppervlak van de cultuur zal lijken op zwart fluweel (figuur 1). Bij 24 uur na het aanbrengen van Tween het oppervlak van de agar moet een lichte glans. Als mycelia weer verschijnen, dan is de plaat mag niet genoeg zijn geschraapt om perithecium ontwikkeling te induceren. Ascospore ontslag Zorg altijd voor in uw test een aantal blokken van agar van de wild-type stam. Als u hier geen brand, dan is ofwel uw perithecia zijn te jong of te oud. Als ze te oud zijn, dan is een groot aantal hyfen zal verschijnen over het oppervlak van de cultuur waardoor het een witte tint. Indien dit niet het geval is, kan zij te jong de test opnieuw moet worden beproefd in 24 uur. Af en toe een cultuur heeft geen goed ontladen, en het experiment zal moeten worden herhaald. Zorg ervoor dat u de test onder de juiste lichtomstandigheden. Recombinant nageslacht <p class="jove_content"> Recombinant perithecia moet de meerderheid van perithecia langs de kruising tussen de twee stammen. We gewoonlijk proces 10 cirrhi een kruis minstens 4-6 van deze moet recombinant. Heel af en toe, een mutatie voorkomt dat een soort van dekking. Als een van de ouders een afwijkende groei fenotype, dan meer dan 2 fenotypen aanwezig zijn tussen de kolonies MMT. Figuur 1. Fasen van perithecium ontwikkeling op wortel agar. Links, 72 uur na het aanbrengen van Tween. Opmerking rood pigment zeer jonge perithecia zichtbaar als een zwart korrels aan het oppervlak. Rechts, op 144 uur, hebben volwassen perithecia gevormd. Let op bijna volledige afwezigheid van oppervlakkige mycelia in beide culturen. Figuur 2. Discharge assay. De oranje wortel agar plug is gericht zo that sporen gedwongen afgevoerd uit de rijpe perithecia op het oppervlak kan ophopen op het oppervlak van het glaasje. 15 uur accumulatie tijd. Figuur 3. Verschillen in groei tussen Nit + en NIT-kolonies op selectieve MMT's medium. De NIT-kolonies (pijlpunten) zijn kleiner. De Nit + kolonies (pijlen) tonen een sterke groei. Foto genomen na 7 dagen.