שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ"א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP
Summary
צעד אחר צעד לפרוטוקול בידוד וזיהוי RNA מתחמים הקשורים באמצעות RIP שבב.
Abstract
כתוצאה מההתפתחות של רצף תפוקה גבוהה וניתוח microarray יעיל, ניתוח ביטוי גנים העולמי הפך צורה קלה וזמינה של איסוף נתונים. במחקר רב ומודלים למחלות עם זאת, רמות המצב יציבות של mRNA גן היעד לא תמיד לתאם ישירות עם רמות חלבון המצב יציבות. רגולציה של גנים לאחר השעתוק היא הסבר סביר של הסטייה בין שתיים. מונע על ידי הקשירה של חלבונים מחייבים RNA (RBP), רגולציה שלאחר השעתוק משפיעה לוקליזציה-mRNA, יציבות ותרגום על ידי יצירת Ribonucleoprotein (RNP) מורכבת עם mRNAs היעד. זיהוי מטרות de mRNA נובו הידועות אלה מתמציות סלולריות במתחם RNP הוא מרכזי להבנת מנגנונים ופונקציות של RBP וההשפעה שלהם על תוצאת פלט חלבון. פרוטוקול זה מתאר שיטה כינתה RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), המאפשרת לזיהוי שלmRNAs pecific קשור במתחם ribonucleoprotein, תחת תנאי ניסוי משתנה, יחד עם אפשרויות לייעול נוסף לניסוי לחוקר הבודד. בכלי ניסיוני חשוב זה, חוקרים יכולים לחקור את המנגנונים המורכבים הקשורים לרגולציה של גנים שלאחר שעתוק, כמו גם אינטראקציות ribonucleoprotein אחרות.
Protocol
Discussion
בשל האופי של ניסוי, אופטימיזציה וניסיון זה יהיו הדרכים מובטחות רק כדי לרכוש את התוצאות המצופות בהצלחה. בשלבים רבים של הליך זה, טמפרטורה וטיפול יעיל של חומרים הכימיים ומוצרים הם חשובים וקריטיים. תכנון וביצוע של טכניקה נכון יעזרו להבטיח כי הניסוי בוצע במסגרת זמן מתאימה בטמפרטורה האופטימלית המומלצת. נושא מרכזי בניסויי בידוד RNA הוא הרגישות של RNAs לשפלה ידי RNases. כל ריאגנטים צריכים להיות RNase חופשי ומאוחסן או משמש במכולות RNase חינם. זה הוא שלב קריטי בהבטחת השלמות של מדגם mRNA שלך. גם כאשר הניסוי מבוצע כראוי, עם זאת, התוצאה הרצויה לא יכולה להיות מושגת בשל האופי של האינטראקציה בין RBP וmRNAs היעד שלה.
בעיה פוטנציאלית אחת היא שיש נמוכה או אפילו אין אות מרנ"א מבודד על ידי RIP שבב.למרות שעשוי להיות אות מ-RNA המוחלט, זה עשוי להיות תוצאה של חלבון מחייב לקוי שנגרר על ידי החרוזים. הצעד הראשון הוא פתרון הבעיות כדי לאשר שlysate הסלולרי בשימוש יש ביטוי נאות RBP הספציפי. עם האישור, חלבון יכול להיות מבודד לאחר NT2 השטיפה הסופית וresuspended במאגר Laemmli או אחר חיץ denaturing מתאים ומחומם על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ניתוח הכתם מערבי ניתן להשתמש בדגימות אלה בתיאום עם lysate קלט כמו גם בקרות שליליות כדי להבטיח מספיק למשוך למטה של חלבון קשור.
יתר על כן, בגלל lysing התא נדרש כדי לגשת לרכיבים אלה, הפוטנציאל לאינטראקציות בלתי תקינות ובלתי רצויות בין חלבונים וmRNA בדרך מופרדים עשוי להיות מוצג. אינטראקציות אלה עלולות להיקשר ו" לספוג "mRNAs היעד שלך או החלבונים מחייבים דרך אינטראקציות לא ספציפיות. בנוסף, חלבונים אלו בשיתוף שונהnditions יכול לקפל בוריאציות שונות, והמוטיבים המחייבים שלהם עשויים להיות נגישים לmRNAs היעד שלהם, ומונעים האינטראקציות ביניהם. שני אלה מחזקים את החשיבות של עבודה ביעילות, כמו גם ניצול האופטימלי הטמפרטורות מפורטים להגביל אינטראקציות בלתי רצויות אלה. בנוסף, אופטימיזציה של שטיפת תנאים לכל חלבון המטרה ספציפי תהיה קריטית למקסם את הטוהר של האינטראקציה. תנאים מחמירים יותר להדחה עשויים להיות נחוצים. לדוגמה, החיץ לשטוף ניתן להשלים עם SDS או כמות מתאימה של אוריאה להפחית אינטראקציות ורקע לא ספציפיות באות הפלט שלך. זה יהיה תלוי לחלוטין בRBP היעד של הנסיין, כמו גם את ה-mRNA היעד בתנאים הפיסיולוגיים הייחודיים שלהם. תנאים מסוימים לא יהיו מתאימים לכלים מסוימים mRNA ניתוח, שיצוינו בהכנת דגימות.
לבסוף, למרות RIP הוא מוצלח בהעשרה של רנ"אאינטראקציות RBP, בעיה מוכרת היטב עם שיטת RIP (שבב) היא חוסר היכולת לזהות את התחומים המחייבים הספציפיים של RBP על יעדי mRNA החולפים. כמה טכניקות צלב מקשר-יכולים לשמש אחרי RIP לבודד יעדי רצף ייחודיים, עם זאת, השימוש בקרינת UV בגלים קצרים נוטה להוביל לניזק חומצות גרעין. שיטה חדשה המכונית PAR-CLIP, או crosslinking ribonucleoside photoactivatable וimmuoprecipitation, מעסיקה ארוך UV-גל לשלב thiouridine לרנ"א המתהווה המאפשר זיהוי של אתרי קישור ייחודיים מאינטראקציות RNA הוא יציבות וחולפות.
בסך הכל, שבב RIP הוקם ככלי מצוין המשמש לבודד ולבחון את יחסי גומלין בין חלבונים המחייבים RNA ויעדי mRNA שלהם על ידי הקבוצה שלנו, כמו גם רבות קבוצות מחקר אחרות. למרות רגיש בטבע ובפועל, ביצוע נכון של הליך זה יניב את הבידוד של קומפלקסי RNP אלה, שעד לא מזמן, היה inaccessible לגילוי וניתוח.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
משרד ההגנה (פרס הרעיון W81XWH-07-0406) – כדי Ulus אטסוי
NIH RO1 A1080870 – כדי Ulus אטסוי
NIH R21 A1079341 – כדי Ulus אטסוי
אוניברסיטת מיזורי קרנות מוסדיות – כדי Ulus אטסוי
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M dithiothreitol | Fisher | BP172-5 | DTT |
| DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
| Ethylendiamine Tetraccetic Acid | Fisher | BP118-500 | EDTA |
| Glycogen | Ambion | 9516 | |
| 1 HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
| Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
| 1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
| 1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| NT2 Buffer | *See Below | ||
| Polysome Lysis Buffer | *See Below | ||
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11873580001 | |
| Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| RNase Out RNase inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
| 1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-500 | SDS |
| 1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | New England Labs | S1402S | VRC |
| Reagent Workup |
| Prepare reagents in RNase/DNase-free, DEPC-treated glassware |
| Polysome lysis Buffer |
| 100 mM KCl |
| 5 mM MgCl2 |
| 10 mM HEPES (pH 7.0) |
| 0.5% NP40 |
| 1 mM DTT |
| 100 units/ml RNase Out |
| 400 μM VRC |
| Protease inhibitor cocktail tablet |
| 5 ml of Polysome lysis buffer |
| Add 50 μl of 1 M HEPES (pH 7.0) |
| 500 μl of 1 M KCL |
| 25 μl of 1 M MgCl2 |
| 25 μl of NP40 |
| 4.7 ml RNase-DNase-free H2O |
| 50 μl of 1 M DTT |
| 12.5 μl of 100 U/ml RNase Out |
| 200 μl Protease inhibitor cocktail (dissolved according to manufacturer) |
| 10 μl 200 mM VRC (at time of use) |
| NT2 Buffer |
| 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) |
| 150 mM NaCl |
| 1 mM MgCl2 |
| 0.05% NP40 |
| 1 L of NT2 Buffer |
| 50 ml Tris (pH 7.4) |
| 30 ml 5 M NaCl |
| 1 ml 1 M MgCl2 |
| 500 μl NP40 |
| 820 ml RNase-DNase-free H2O |
Riferimenti
- Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).
- Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. L., Ulus Atasoy, U. Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis. Cell Cycle. 9, 3337-3346 (2010).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nature Protocols. 1, 302-307 (2006).
- Tenenbaum, S. A., Lager, P. J., Carson, C. C., Keene, J. D. Ribonomics: identifying mRNA subsets in mRNP complexes using antibodies to RNA-binding proteins and genomic arrays. Methods. 26, 191-198 (2002).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Atasoy, U., Keene, J. D. Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera. Gene. 317, 79-87 (2003).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14085-14090 (2000).
- Baroni, T. E., Chittur, S. V., George, A. D., Tennebaum, S. A. Advances in RIP-Chip Analysis. Methods in Molecular Biology. 419, 93-108 (2008).
- de Silanes Lopez, I., Zhan, M., Lal, A., Yang, X., Gorospe, M. Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2987-2992 (2004).
- de Silanes Lopez, I., Lal, A., Gorospe, M. HuR: post-transcriptional paths to malignancy. RNA Biol. 2, 11-13 (2005).
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide analysis of mRNA stability using transcription inhibitors and microarrays reveals posttranscriptional control of ribosome biogenesis factors. Mol. Cell Biol. 24, 5534-5547 (2004).
- Hieronymus, H., Silver, P. A. Genome-wide analysis of RNA-protein interactions illustrates specificity of the mRNA export machinery. Nat. Genet. 33, 155-161 (2003).
- Hieronymus, H., Yu, M. C., Silver, P. A. Genome-wide mRNA surveillance is coupled to mRNA export. Genes Dev. 18, 2652-2662 (2004).
- Mukherjee, N., Corcoran, D. L., Nusbaum, J. D. Integrative Regulatory Mapping Indicates that the RNA-Binding Protein HuR Couples Pre-mRNA Processing and mRNA Stability. Molecular Cell. 43, 1-13 (2011).
