A primaria del sistema cultura Neuron per lo Studio della latenza del virus Herpes Simplex e la riattivazione
Summary
Il protocollo descrive un sistema modello efficiente e riproducibile per studiare herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) latenza e riattivazione. Il dosaggio utilizza omogenei culture neurone simpatico e consente la dissezione molecolare del virus-neurone interazioni utilizzando una varietà di strumenti interferenza tra RNA e l'espressione di proteine ricombinanti.
Abstract
Herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) stabilisce una vita lunga infezione latente nei neuroni periferici. Questo serbatoio latente è la fonte di eventi riattivazione ricorrenti che garantiscono la trasmissione e contribuire alla malattia clinica. Antivirali attuali non influenzano il serbatoio latente e non ci sono vaccini. Mentre i dettagli molecolari di replicazione litico sono ben caratterizzati, meccanismi che controllano la latenza nei neuroni rimangono elusivi. La nostra attuale comprensione di latenza è derivato da studi in vivo su modelli animali di piccole dimensioni, che sono stati indispensabili per la definizione dei requisiti dei geni virali e il ruolo delle risposte immunitarie. Tuttavia, è impossibile distinguere effetti specifici sul virus-neurone rapporto da conseguenze più generali di infezione mediati da cellule immunitarie di sostegno o non neuronali in animali vivi. Inoltre, la sperimentazione animale è costosa, richiede tempo, e limitate in termini di opzioni disponibili per la manipolazione di accoglienzaprocessi. Per superare queste limitazioni, un neurone solo sistema è disperatamente necessario che riproduce la vivo nelle caratteristiche di latenza e la riattivazione, ma offre i vantaggi di coltura tissutale in termini di omogeneità e di accessibilità.
Qui vi presentiamo un modello in vitro utilizzando colture di neuroni primari dai gangli simpatici rat cervicale superiore (SCG) (Figura 1) per studiare HSV-1 la latenza e la riattivazione che si adatta maggior parte se non tutti i criteri desiderati. Dopo aver eliminato cellule non neuronali, vicino omogenei TrkA + colture neuronali sono infettati con HSV-1 in presenza di acyclovir (ACV) per sopprimere la replicazione litico. Dopo la rimozione ACV, non produttivi infezioni da HSV-1 che presentano caratteristiche fedelmente accettato di latenza sono stabiliti in modo efficiente. In particolare, mRNA litici, proteine e virus infettivo diventa non rilevabile, anche in assenza di selezione, ma latenza associata trascrizione (LAT) expression persiste in nuclei neuronale. Genomi virali sono mantenuti ad un numero medio di copie 25 per neurone e possono essere indotte a replicare produttivamente interferendo con PI3-chinasi / Akt segnalazione o il ritiro semplice del nerve growth factor 1. A ricombinante HSV-1 EGFP codifica fusa alla proteina virale US11 litico fornisce uno funzionale, in tempo reale marcatore per la replica risultante da riattivazione che è facilmente quantificato. In aggiunta ai trattamenti chimici, metodologie genetiche come la RNA-interferenza o il gene di consegna attraverso vettori lentivirali può essere applicato con successo al sistema di autorizzazione gli studi meccanicistici che sono molto difficili, se non impossibile, negli animali. In sintesi, il SCG-based HSV-1 la latenza / riattivazione sistema fornisce un potente strumento necessario per svelare i meccanismi molecolari che controllano HSV1 latenza e riattivazione nei neuroni, un puzzle di lunga data in virologia, la cui soluzione può offrire nuove intuizioni nello sviluppo di nuove terapie che obiettivo tsi riserva herpesvirus latente.
Protocol
Discussion
Questa cultura neurone primario e l'infezione del sistema fornisce un metodo semplice ed efficace per esplorare i meccanismi molecolari alla base HSV-1 la latenza e la riattivazione. Il sistema riprende fedelmente le caratteristiche di latenza accettati definiti in entrambe le infezioni umane ed in live-modelli animali. Quando il virus è latente nelle culture SCG, particelle virali infettive e prodotti genici litici non può essere rilevato. L'unico prodotto del gene virale rilevato in neuroni …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i revisori per i loro suggerimenti premurosi che hanno contribuito a migliorare questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni a favore di MVC (NS21072, HD23315), ACW (GM61139, S10RR017970) e IM (AI073898, GM056927) dal NIH. MK è stata sostenuta in parte da una formazione sovvenzione del NIH (5T32 AI007180).
Materials
| Reagent | Company | Catalog# | Comments |
| 70μm nylon filter( cell strainer) | BD Biosciences | 352350 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS-/-) | Invitrogen | 14175 | w/o CaCl2 and MgCl2 |
| 1x Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | prepare 20 mM stock in 1x MEM; store at -20°C |
| 96-well flat well bottom TC plates | Corning | 3599 | |
| Acyclovir | Calbiochem | 114798 | prepare 31 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Aphidicolin | Calbiochem | 178273 | prepare 10 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-44 | |
| Collagenase | Sigma | C2674 | prepare 10 mg/ml stock in HBSS-/-; store at -20°C |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G6152 | prepare 40% stock in H2O; filter sterilize & store at 4°C |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | prepare 1 mg/ml stock in H2O; quick-freeze 20 μl aliquats & store at -80°C; dilute to 2 μg/ml working conc. in sterile H2O |
| Leibovit’z L-15 media | Invitrogen | 11415 | |
| Nerve Growth Factor | Harlan Laboratories | BT.5017 | prepare 50 μg/ml stock in HBSS-/-; store at -80°C |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 12348 | |
| Phosphonoacetic acid (PAA) | Sigma | P6909 | prepare 75 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P0899 | prepare 20 mg/ml stock in H2O; store at -20°C |
| Rat-tail collagen | Millipore | 08-115 | Concentration varies with supply lot; store at 4°C and dilute to 0.66 mg/ml working conc. in sterile H2O |
| Trichostatin A | Sigma | T8552 | prepare 1 mM stock in DMSO; store at -20°C |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |
Riferimenti
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