Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN

Virales adeno-asociados (AAV) vectores representan algunos de los vehículos más potentes y prometedores para la transferencia de gen terapéutico humano debido a una combinación única de propiedades beneficiosas ^1. Estos incluyen el apathogenicity de los virus de tipo salvaje subyacentes y las metodologías muy avanzadas para la producción de alto título, de alta pureza y de grado clínico vectores recombinantes ^2. Una ventaja adicional particular del sistema de AAV sobre otros virus es la disponibilidad de una riqueza de origen natural serotipos que difieren en propiedades esenciales sin embargo, todos pueden ser fácilmente diseñado como vectores utilizando un protocolo común ^1,2. Por otra parte, una serie de grupos, entre ellos el nuestro han creado recientemente las estrategias a utilizar estos virus naturales como plantillas para la creación de vectores sintéticos que, o bien se combinan los activos de los serotipos de entrada múltiples, o que mejorar las propiedades de un solo aislamiento. Las respectivas tecnologías para lograr estos objetivos are ADN de la familia ya sea arrastrando los pies ^3, es decir, la fragmentación de los diversos genes de la cápsida AAV, seguida de su nuevo montaje basado en homologías parciales (normalmente> 80% para la mayoría de los serotipos de AAV), o de visualización ^4,5 péptido, la inserción es decir, que suele ser de siete aminoácidos en un bucle expuesta de la cápsida viral donde el péptido idealmente media re-dirigida a un tipo de célula deseado. Para el mayor éxito posible, ambos métodos se aplican de un modo de alto rendimiento por el que los protocolos están en mayor escala para producir las bibliotecas de alrededor de un millón de variantes diferentes cápside. Cada clon es entonces compuesto de una combinación única de numerosos virus parentales (ADN enfoque arrastrando los pies) o contiene un péptido distintivo en la columna vertebral misma viral (enfoque pantalla péptido). El paso final es iterativo subsiguiente selección de dicha biblioteca sobre las células diana a fin de enriquecer para cápsidas individuales que cumplan la mayoría o idealmente todos los requisitos del proceso de selección. Este último preferiblemente peineines presión positiva, como el crecimiento en un cierto tipo de células de interés, con selección negativa, por ejemplo la eliminación de todas las cápsidas que reaccionan con anticuerpos anti-AAV. Esta combinación aumenta las posibilidades de que cápsidas sintéticos que sobreviven a la selección coincidan con las necesidades de la aplicación dada de una manera que probablemente no se han encontrado en cualquier forma natural AAV aislar. Aquí, nos centramos en el método de ADN de la familia arrastrando los pies como la teórica y experimentalmente más difícil de las dos tecnologías. Se describe y demostrar todos los pasos esenciales para la generación y selección de las bibliotecas barajan AAV (Fig. 1), y luego discutir las dificultades y los aspectos críticos de los protocolos que hay que tener en cuenta a fin de tener éxito con la evolución molecular de AAV.