לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em> תסיסנית</em> עוברים סינסיציאלי
Summary
Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה כרומוזום<em> תסיסנית</em> עוברים באמצעות לייזר Leica מערכת סריקה confocal.
Abstract
הרכבה ציר מחסום (SAC) המנגנון הוא אות הפעיל, העוקב אחר האינטראקציה בין kinetochores כרומוזום microtubules ציר כדי למנוע התפרצות anaphase עד הכרומוזומים מחוברים כראוי. תאים משתמשים מנגנון זה, כדי למנוע חוסר יציבות גנומית או aneuploidy, ולכן סרטן ומחלות אנושיות אחרות, כמו מומים מולדים ואלצהיימר 1. מספר הרכיבים שק כגון Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, רוד ואורורה ב קינאז זוהו והם כל החלבונים דינמיים kinetochore 2. הראיות עולה כי kinetochore הוא שם את האות SAC היא יזמה. המטרה העיקרית היא SAC הרגולציה Cdc20. Cdc20 הוא אחד APC / C (P naphase romoting omplex C או C yclosome) activators חיוניים 3, והוא גם חלבון דינמי kinetochore 4-6. כאשר מופעל, SAC מעכב את הפעילות שלPC / C כדי למנוע את הרס שני מצעים מרכזיים, cyclin B ו-securin, ובכך למנוע metaphase כדי anaphase המעבר 7,8. בדיוק איך האות SAC הוא יזם התאספו על kinetochores את ומסר על הנגמ"ש / C לעכב את תפקידו עדיין נשאר חמקמק.
תסיסנית היא מערכת ניסיונית צייתן מאוד, אורגניזם פשוט יותר וטוב יותר מובנות לעומת האדם אבל אף אחד כי תהליכים מניות יסוד משותפים. זהו, אולי, אחד היצורים הטובים ביותר לשימוש עבור ביו הדמיה מחקרים בתאים חיים, במיוחד עבור הדמיה של אירועי mitotic במרחב ובזמן, שכן העובר בשלב מוקדם עובר 13 מחזורים מהירים חטיבת גרעיני באופן סינכרוני (8-10 דקות לכל מחזור של 25 ° C) ולאט לאט מארגנת גרעינים בשכבה יחידה בדיוק מתחת קליפת המוח 9.
הנה, אני מציג את שיטת ביו הדמיה באמצעות מהונדס תסיסנית הבעהשרים GFP (חלבון ירוק זרחני) או חלבונים גרסה במיקוד שלה של ריבית TCS Leica SP2 confocal מערכת לייזר מיקרוסקופ סריקה כדי ללמוד את הפונקציה SAC אצל זבובי, על ידי הצגת תמונות של חלבונים GFP שילוב של כמה מרכיבים SAC, Cdc20 ו Mad2 , כמו בדוגמה.
Protocol
Discussion
פרוטוקול המתוארת כאן היא שיטה גנרית עבור הדמיה לטוס עוברים סינסיציאלי באמצעות TCS Leica SP2 confocal מיקרוסקופ לייזר סורק והוא יכול להיות שונה כדי להתאים מערכות מיקרוסקופ אחרים, ויכול גם להיות מותאם ללמוד פונקציות גנים אחרים באמצעות עוברים תסיסנית סינסיציאלי. השתמשנו בפרוטוקול זה ללמוד היבטים רבים של המחסום ציר הרכבה, הדינמיקה חלבון proteolysis חלבון מהונדס באמצעות זבובים או נוגדנים polyclonal לדמיין לוקליזציה חלבונים בדגימות חיים או קבועים 4,6,12-14.
היא הפשוטה ביותר לשמור על זבובים ב צלוחיות מזון טרי לטוס בעת איסוף מספר קטן (~ 10-100) של ביצים. פעולה זו מפחיתה את הטרחה של ביצוע והכנת נוספים אגר מיץ תפוחים צלחות איסוף בתאי ביצה כפי שמתואר בפרסומים אחרים 15,16. תוספת של ריבוע קטן של זכוכית שבורה coverslip בקצה אחד של רצועת דבק על coverslip עושה את זה הרבה יותר קלכדי לפתוח את המחט לקבוע את עוצמת הזריקה באמצעות התאמת מערכת הגדרות microinjection תוך המחט הוא לטבול בשמן 10s. מידת התייבשות העובר חשוב להצלחה של הזריקה למניעת דליפות ושמירה על יכולת הקיום עוברים במיוחד עבור אלה ניסויים הדורשים תקופת זמן ארוכה או כאשר העלאת transformants לאחר ההזרקה. עם זאת, אין כלל הזהב עבור בדיוק כמה זמן נדרש התייבשות. פעולה זו שונה בין ניסוי לניסוי וגם תלוי בכמות של פתרון מוזרק והלחות של סביבת העבודה.
פונקציות של חלבון מסוים שמעניין ניתן להשפיע על ידי microinjecting מעכבי חלבונים ספציפיים, מונו או פולי משובט נוגדנים נגד חלבון מסוים, RNA שליח או פפטידים שכותרתו fluorescently תחת סוג בר או רקע מוטציה גנטית. רבים מאותם קווים מוטנטים או GFP-מתוייגים קווי מהונדס הם באב פומביתailable מ תסיסנית מניות מרכזי ורובם מפורטים על Flybase ( http://flybase.org/~~V ), ואפשר לחפש באינטרנט.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרוטוקול זה פותח תחת האמון Wellcome גרנט. אנו מודים לגב 'מורין סינקלייר לשמירה המניות לטוס והכנת מזון זבוב עם השנים. אנו רוצים גם להודות למר מיכאל אייצ'יסון על עזרתו ותמיכה טכנית בפיתוח של פרוטוקול זה.
Materials
Essential equipment and reagents:
Confocal imaging system: The imaging system described in this protocol is a Leica TCS SP2 laser scanning confocal inverted microscope system. The method described is also suitable perhaps with some minor modifications for other imaging systems.
Dissecting microscope: We use an Olympus SZX7 with DF PLAPO 1X-4 lens.
Needle puller: Flaming/brown micropipette puller (from Sutter Instrument, Model: P-97).
Microinjection system: An Eppendorf microinjection system is described but any other appropriate system can be used.
Fly food distributor: Jencons Scientific Ltd peristaltic pump.
Reagents:
| Ingredients | Weights | Risorse | Lot No. |
| Maize meal | 100.0g | SUMA, UK | |
| Brown sugar | 50.0g | Billington’s, UK | |
| Dry yeast | 25.0g | DCL YEAST Ltd. UK | |
| Agar | 12.5g | Fisher Scientific | 106556 |
| Sorbic acid | 0.4g | BDH, VWR International Ltd. UK | 8829310 |
| Benzoic acid | 2.9g | Fisher Scientific | 1019599 |
| Nipagin (Methyl -4-Hydro xybenzoate) |
0.9g | BDH, VWR International Ltd. UK | K35969015 |
| H2O up to 1L | |||
Table 1. Fly food ingredients.
Holocarbon 700 and 27 oils purchased from Sigma.
Dry yeast: Thomas Allison, UK.
Preparing the heptane glue: Take about 1.5 meters of double-sided Scotch tape, put it into a 15ml Falcon tube with 5ml of heptane and rotate for 3-5 hours or overnight. After that time split into 4 equal aliquots in 1.5 ml eppendorf centrifuge tubes and spin for 5 min at a fast speed in a bench-top centrifuge to remove any debris. Store the heptane glue solution in a 10ml volumetric flask and keep for use. The glue strength will vary according to the concentration and the amounts of the glue used. Normally, the thinner glue produces lesser noisy background when scanned by confocal microscope.
- Coverslip: BDH, VWR International Ltd. UK
- Microscope slide: BDH, VWR International Ltd. UK
- Siliconised glass capillaries: GC-100-10, Harvard
- Fine loading tip: 20μl eppendorf lot: W215818J
- Tweezers
- Fine pen brush
Riferimenti
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).
- Zekanowski, C., Wojda, U. Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer’s disease. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).
- Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. Flies without a spindle checkpoint. Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).
- Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint. Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).
- Huang, J., Raff, J. W. The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells. EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).
- Xia, G. Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint. Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).
- Lorca, T. Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts. Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).
- Howell, B. J. Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation. J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).
- Foe, V. E., Alberts, B. M. Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis. Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).
- Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).
- Karess, R. E., Glover, D. P element mediated germ line transformation of Drosophila. DNA cloning: A practical approach. 2, 121-141 (1985).
- Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos. Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).
- Huang, J. Y., Raff, J. W. The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised. Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo. J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).
