دراسة حاجز الميتوزى بواسطة يوضح الحيوي Kinetochore السلوك البروتين والحركة كروموسوم في المعيشة<em> ذبابة الفاكهة</em> الجنين المخلوي
Summary
وkinetochore هو المكان الذي يبدأ SAC الاشارة رصد الفصل الإنقسامية من chromatids شقيقة. تم وصف طريقة لتصور التوظيف ودوران واحد من البروتينات kinetochore والتنسيق مع الحركة في كروموسوم<em> ذبابة الفاكهة</em> أجنة باستخدام نظام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر لايكا.
Abstract
حاجز الجمعية المغزل (SAC) آلية هي إشارة نشط، والذي يراقب التفاعل بين kinetochores كروموسوم وميكروتثبول المغزل للحيلولة دون ظهور طور الصعود حتى ترتبط بشكل صحيح الكروموسومات. الخلايا استخدام هذه الآلية لمنع عدم الاستقرار أو عدم توازن الصبغيات الجينية، وبالتالي السرطان والأمراض البشرية الأخرى مثل العيوب الخلقية ومرض الزهايمر 1. وهناك عدد من المكونات مثل SAC Mad1، Mad2، Bub1، BubR1، Bub3، Mps1، Zw10، وقد تم تحديد ورود أورورا كيناز باء، وأنهم جميعا البروتينات kinetochore الدينامية (2). تشير الدلائل إلى أن kinetochore هو المكان الذي بدأ إشارة ساك. الهدف الرئيسي ساك التنظيمية Cdc20. Cdc20 هي واحدة من وسائل تفعيل APC / C (أ ف naphase romoting C omplex أو yclosome C) (3) وأساسي هو أيضا بروتين kinetochore دينامية 4-6. عند تفعيلها، وSAC يثبط من نشاط وPC / C لمنع تدمير اثنين من ركائز رئيسية، cyclin باء وsecurin، مما يحول دون انتقال الطورية إلى طور الصعود 7،8. بالضبط كيف يتم بدء إشارة SAC وتجميعها على kinetochores ونقلت على لآسيا والمحيط الهادئ / C لمنع وظيفتها لا تزال بعيدة المنال.
ذبابة الفاكهة هو نظام لين العريكة جدا التجريبي؛ كائن أبسط من ذلك بكثير وأفضل مفهومة مقارنة مع واحد ولكن الإنسان الذي أسهم في العمليات الأساسية المشتركة. هو، ربما، واحدة من أفضل الكائنات الحية لاستخدامها في التصوير دراسات البيولوجية في الخلايا الحية، وخاصة بالنسبة للالتصور للأحداث الإنقسامية في المكان والزمان، كما أن الجنين في وقت مبكر يذهب من خلال 13 دورات السريع تقسيم النووية بشكل متزامن (8-10 دقائق لكل دورة على درجة مئوية 25)، وتنظم تدريجيا نوى في أحادي الطبقة واحدة فقط تحت القشرة 9.
هنا، أقدم طريقة الحيوي التصوير باستخدام المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة EXPRESالغناء GFP (الأخضر بروتين فلوري) أو البديل لها استهداف البروتينات من الفائدة وTCS لايكا SP2 نظام ليزر متحد البؤر مجهر المسح لدراسة وظيفة SAC في الذباب، من جراء عرض صور من البروتينات الانصهار GFP من بعض المكونات SAC، Cdc20 وMad2 ، كما في المثال.
Protocol
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا هو طريقة عامة لتصوير الأجنة يطير المخلوي باستخدام TCS لايكا ليزر متحد البؤر SP2 مجهر المسح ويمكن تعديلها لتناسب أنظمة المجهر الأخرى، ويمكن أيضا أن تتكيف مع دراسة وظائف الجينات الأخرى التي تستخدم أجنة ذبابة الفاكهة المخلوي. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لدراسة جوانب كثيرة من حاجز المغزل الجمعية، وديناميات البروتين والتحلل البروتيني بروتين باستخدام الذباب المعدلة وراثيا أو الأجسام المضادة بولكلونل لتصور توطين البروتين في عينات حية أو ثابت 4،6،12-14.
فمن أبسط للحفاظ على الذباب في قوارير جديدة الغذائية ذبابة عند جمع أعداد صغيرة (~ 10 – 100) من البيض. وهذا يقلل من الازعاج من صنع وإعداد لوحات إضافية أجار عصير التفاح والغرف جمع البيض كما هو موضح في غيرها من المنشورات 15،16. إضافة مربع صغير من زجاج مكسور ساترة في واحدة من نهاية الشريط الغراء على ساترة يجعل من الاسهل بكثيرلفتح إبرة وتحديد حجم حقن عن طريق ضبط إعدادات النظام microinjection بينما الإبرة وتخبط في مجال النفط 10S. درجة جفاف الجنين من المهم لنجاح الحقن في تجنب التسربات والحفاظ على سلامة الأجنة وخاصة لأولئك التجارب التي تحتاج إلى فترة طويلة من الوقت أو عندما رفع transformants بعد الحقن. ومع ذلك، لا توجد قاعدة ذهبية للبالضبط كيف طويل هو مطلوب جفاف. هذا يختلف من تجربة إلى تجربة ويعتمد على مقدار من الحل حقن والرطوبة في بيئة العمل.
يمكن التلاعب بها وظائف بروتين معين من الاهتمام من قبل microinjecting مثبطات بروتين معين، أحادية أو بولي نسيلي أجسام مضادة ضد بروتين معين، أو الحمض النووي الريبي رسول الببتيدات fluorescently المسمى تحت نوع البرية أو الخلفيات طفرة جينية. كثير من هذه الخطوط أو متحولة GFP الموسومة خطوط المعدلة وراثيا هي مركبات علناوترد ailable من مراكز الأوراق المالية ذبابة الفاكهة ومعظمها في Flybase ( http://flybase.org/~~V ) ويمكن البحث على الانترنت.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تطوير هذا البروتوكول في إطار منحة يلكوم ترست. نشكر السيدة مورين سينكلير للحفاظ على مخزون الطاير وإعداد الطعام ذبابة على مر السنين. ونود أيضا أن نشكر السيد مايكل Aitchison لمساعدته وتقديم الدعم التقني في البلدان النامية من هذا البروتوكول.
Materials
Essential equipment and reagents:
Confocal imaging system: The imaging system described in this protocol is a Leica TCS SP2 laser scanning confocal inverted microscope system. The method described is also suitable perhaps with some minor modifications for other imaging systems.
Dissecting microscope: We use an Olympus SZX7 with DF PLAPO 1X-4 lens.
Needle puller: Flaming/brown micropipette puller (from Sutter Instrument, Model: P-97).
Microinjection system: An Eppendorf microinjection system is described but any other appropriate system can be used.
Fly food distributor: Jencons Scientific Ltd peristaltic pump.
Reagents:
| Ingredients | Weights | Risorse | Lot No. |
| Maize meal | 100.0g | SUMA, UK | |
| Brown sugar | 50.0g | Billington’s, UK | |
| Dry yeast | 25.0g | DCL YEAST Ltd. UK | |
| Agar | 12.5g | Fisher Scientific | 106556 |
| Sorbic acid | 0.4g | BDH, VWR International Ltd. UK | 8829310 |
| Benzoic acid | 2.9g | Fisher Scientific | 1019599 |
| Nipagin (Methyl -4-Hydro xybenzoate) |
0.9g | BDH, VWR International Ltd. UK | K35969015 |
| H2O up to 1L | |||
Table 1. Fly food ingredients.
Holocarbon 700 and 27 oils purchased from Sigma.
Dry yeast: Thomas Allison, UK.
Preparing the heptane glue: Take about 1.5 meters of double-sided Scotch tape, put it into a 15ml Falcon tube with 5ml of heptane and rotate for 3-5 hours or overnight. After that time split into 4 equal aliquots in 1.5 ml eppendorf centrifuge tubes and spin for 5 min at a fast speed in a bench-top centrifuge to remove any debris. Store the heptane glue solution in a 10ml volumetric flask and keep for use. The glue strength will vary according to the concentration and the amounts of the glue used. Normally, the thinner glue produces lesser noisy background when scanned by confocal microscope.
- Coverslip: BDH, VWR International Ltd. UK
- Microscope slide: BDH, VWR International Ltd. UK
- Siliconised glass capillaries: GC-100-10, Harvard
- Fine loading tip: 20μl eppendorf lot: W215818J
- Tweezers
- Fine pen brush
Riferimenti
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).
- Zekanowski, C., Wojda, U. Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer’s disease. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).
- Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. Flies without a spindle checkpoint. Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).
- Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint. Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).
- Huang, J., Raff, J. W. The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells. EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).
- Xia, G. Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint. Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).
- Lorca, T. Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts. Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).
- Howell, B. J. Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation. J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).
- Foe, V. E., Alberts, B. M. Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis. Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).
- Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).
- Karess, R. E., Glover, D. P element mediated germ line transformation of Drosophila. DNA cloning: A practical approach. 2, 121-141 (1985).
- Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos. Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).
- Huang, J. Y., Raff, J. W. The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised. Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).
- Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo. J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).
