特定のエンド - およびエキソグリコシダーゼを用いたタンパク質のグリコシル化の同定と特性評価

1。酵素的脱グリコシル化蒸発による水分の損失を最小限にするためにPCRチューブを使用してください。チューブ1の7のラベルが一組。 10X G7バッファ、10X糖タンパク質変性緩衝液、および10％のNP – 40を融解し、穏やかに内容物を混合するためにチューブをタップします。室温で保管してください。 氷上で酵素含有バイアルを置きます。融解/凍結サイクルを最小限に抑えるようにしてください。 のdH 2 O 600μlのhCGβバイアル（150μg）の内容を溶解し、氷上に置きます。 のdH 2 Oで10倍株式を希釈することにより1X G7バッファー1mlを準備 25μlの1X G7バッファにPNGase Fの0.5μlを希釈し、氷上に置きます。 2μlのα- N -アセチル、α1- 2フコシダーゼ、β1- 3ガラクトシダーゼ、およびα1- 3、6ガラクトシダーゼのそれぞれを組み合わせることにより、エキソグリコシダーゼのミックスを（EGミックス）の準備。 示されるようにPCRチューブを設定します。 AK"> チューブ/サンプル＃ 1 2 3 4 5 6 7 hCGβ（0.25mg/ml） 9μl 9μl 9μl 9μl – – – 10X糖タンパク質変性緩衝液 1μlの 1μlの 1μlの 1μlの 1μlの 1μlの 1μlののdH 2 O – – – – 9μl 9μl 9μl 穏やかに混合しての場所、チューブにキャップをサーモは、蓋を閉じ、94℃で10分インキュベートすることによりタンパク質を変性° 4 ° Cホールドが続くC、（サーモサイクラーにPCRチューブを使用しては非常に少量のサンプルで蒸発を防ぎます）。 目に見える結露を除去するサーモサイクラーと遠心機からチューブを外します。 示されるように以下の試薬を追加します。 サンプル＃ 1 2 3 4 5 6 7 10％のNP – 40 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 10X G7バッファ 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5＆ムー、L 2.5μl PNGase F 1：50 DIL。 – 2μlの – – 2μlの – – 脱グリコシルミックス – – 2μlの 2μlの – 2μlの 2μlの EGミックス – – – 2μlの – – 2μlののdH 2 O 10μlの 8μl 8μl 6μl 8μl 8μl 6μl 全反応巻。 25μlの 25μlの 25μlの 25μlの </ TD> 25μlの 25μlの 25μlの 新しいキャップを使用してPCRチューブの蓋を閉め（その一インキュベーションサイクル後に適切にフィットしないので、使用されているものを破棄する）。 優しく4回タップしてチューブをミックスして、内容をスピンダウン。 4時間℃で、その後4℃に試料を冷却37℃サーモサイクラーとインキュベートにチューブを入れ 2。脱グリコシル化のサンプルのSDS – PAGE 1.25M DTT、4μlを添加して130μlの新鮮な3X還元SDSローディングバッファーを準備します。 各サンプルに準備さ3X還元SDSローディングバッファーの12.5μlを添加します。 新しいキャップとチューブの蓋を閉め、穏やかに混合するためにチューブをタップします。 94℃サーモサイクラーにチューブをインキュベート° C、4℃まで冷却後、5分間とするための各サンプルの30μlの10〜20％トリス – グリシンゲル上のタンパク質マーカーの10μlをロードします。パート3.1のサンプルの残りを保存します。 ColorPlusプレステタンパク質マーカー10μlをロードします。 色素フロントがゲルの底に近くなるまで、室温で130ボルトでゲルを電気泳動させる。 ゲルの実行が終了すると、キャストからゲルを削除し、十分なCoomasie青ゲルをカバーするために染色、小さなプラスチック製の箱に入れてください。 穏やかに攪拌しながら1時間ゲルを染色する。 脱色液50ml中で30分間ゲル3回洗浄する。 白色光のトランスやスキャナーを使って画像を記録する。また、ゲルは、フレームにセロファンのシートの間に乾燥させることができる。 3。 SDS – PAGEゲルでのグリコシル化タンパク質の検出用Pro – Qエメラルド300 2.1のゲル）と並行して、10〜20％トリス – グリシンゲルにサンプルの残りをロードする。負荷10＆ムー; ColorPlusプレステタンパク質マーカーlの。 ゲルは、DMFでのPro – Qエメラルドの試薬を溶解し、株式の修正を準備し実行している間、プロ- Qエメラルド300の洗浄と酸化性ソリューションは、キットに付属の製品マニュアルは、次の染色。 電気泳動が完了すると、キャストからゲルを取り出し、プラスチックボックスに入れてください。 修正液100 mlを追加し、穏やかに撹拌しながら室温で一晩、それを残すことによってゲルを修正。 ジェンティーレ撹拌しながら室温で10〜20分間洗浄溶液100mlでゲルを洗浄してください。新鮮な洗浄溶液で洗浄を繰り返します。 ソリューションを酸化25ml中で30分間穏やかに撹拌しながらゲルをインキュベートすることによって炭水化物を酸化する。 ステップ3.5で説明したようにゲルを洗浄してください。 ゲルは、エメラルド300のステップ3.2〜25ミリリットルに溶解したプロ- Qエメラルド300試薬溶液500μlを添加して染色新鮮プロ- Qの準備を洗浄している間キットに含まれているバッファを染色。 ステップ3.8で作成した染色液の25 mlを加え、90〜120分間穏やかに撹拌しながら、暗所でインキュベートすることにより、ゲルを染色する。 ステップ3.5で説明する2つの洗浄手順を繰り返します。 300nmのでUVトランスイルミネーターで画像を記録します。プレステラダーを示すゲルの白色光の画像にUV画像を重なるようにプロ- Qエメラルドグリーンで標識されている80kDaのマーカーを、使用してください。 ステップ3.11からプロ- Qエメラルド染色ゲルでステップ2.10でCoomasie染色ゲルの画像を比較。 4。代表的な結果酵素脱グリコシル化後のタンパク質の移動の変化を図2に示されています。 PNGase Fの治療（N -結合型糖鎖の除去、レーン2）、および脱グリコシル化のミックス（;プラスエンド-およびO -結合型糖鎖を除去するエキソグリコシダーゼ、レーン3 PNGase F）と（パネルA、レーン1）コントロールのサンプルを比較。それ以上の低下なしサイズで追加のグリコシダーゼ（レーン4）で消化した後に見られている。糖鎖が除去される質量の変化に加えて、バンドがシャープになる。 17kDaのマーカー（アスタリスク）の下で実行されているバンドは完全に脱グリコシル化hCGβポリペプチド（：16 kDaのMW）を表します。他のバンドは、不完全な脱グリコシル化またはhCGβ、試料中に存在する複数の未同定タンパク質（レーン1参照）から派生させるかもしれない。レーン5〜7は、（コントロール）グリコシダーゼに対応するバンドを示す。 エメラルドグリーンによる糖タンパク質の染色は、この試薬は、タンパク質の分子中に存在するすべての糖鎖を酸化し、汚れのパネルBに示されています。 hCGβを酵素（レーン4〜レーン1）脱グリコシル化されているため、信号の強度が低下する。レーン3および4における残差信号は、使用する酵素に耐性である糖鎖のモチーフ、の存在を示している。レーン4で使用される追加のグリコシダーゼは、いくつかの余分な糖残基を削除する：蛋白質の移行は同じですが、染色の強度のわずかな減少が見られる。耐糖部分は、すべての種類のタンパク質にも存在しません：いくつかのバンドは、それらが広範囲に脱グリコシル化されたことを示す、エメラルドグリーン（括弧内の、UV画像には存在しない）によって検出されなかった。追加データは、hCGβが不均一にグリコシル化されているという結論を支持。レーン2の上側のバンドは多くの糖鎖のグループがまだ存在していることを示し、明るい間にレーン2（矢印）の下側のバンドは、エメラルドグリーンの画像上で気絶です。これらのデータは、マウスの細胞で発現させた組換えhCGβは、複数のグリコフォーム9を含んでいるという結論をサポートしています。であっても同じタンパク質上にあれば、そうでないもの、これらの異なるグリコフォームはいくつかのポリペプチドは、それぞれのコンセンサス部位および/またはいくつかの糖鎖に糖鎖を受信しないグリコシル化の本質的な異質性に起因するものが拡張されています。 図1。分泌または細胞表面の糖タンパク質の典型的なグリコシル化パターン。 hCGβの酵素的脱グリコシル化を示す図2。SDS – PAGEゲル。パネルBは、グリコシル化タンパク質の可視化のためのPro – Qエメラルド300の結果を示しながら、パネルCoomasieブルー染色を示す。サンプル数：1、hCGβ制御、2、PNGase F消化、3、脱グリコシル化のミックスの消化、4、脱グリコシル化Mix Plusのエキソグリコシダーゼ消化、試料5〜7（O – Glyc、O -グリコシダーゼ試薬のコントロールであり、GNA、β- N -アセチルグルコサミニダーゼ、ギャル/フコース、β1- 3ガラクトシダーゼ、α1- 3、6ガラクトシダーゼ、およびα1- 2フコシダーゼ、GalNA、α- N – Acetylglalactosaminidase、ノイ、ノイラミニダーゼ、PNGase、PNGaseのF）