Isolering og kultur for Human Fungiform Taste papillae Cells
Summary
Vi ønsket å utvikle en reproduserbar protokoll for å isolere og vedlikeholde langsiktige kulturer av humane fungiform smak papiller celler. Celler fra menneskelig fungiform papillae fremstilt ved biopsi ble vellykket opprettholdt i kulturen for mer enn åtte passasjer (12 måneder) uten tap av levedyktighet.
Abstract
Smak celler er svært spesialiserte, med unike histologiske, molekylære og fysiologiske egenskaper som tillater påvisning av et bredt spekter av enkle stimuli og komplekse kjemiske molekyler som finnes i matvarer. I menneskelig, individuell fungiform papillae inneholde fra null til så mange som 20 smaksløker. Det er ingen etablert protokoll for dyrking menneskelige smak celler, selv om evnen til å opprettholde smak papiller celler i kultur for flere celle sykluser ville være av stor nytte for å karakterisere den molekylære, regenerativ, og funksjonelle egenskapene til disse unike sanseceller. Tidligere studier av smak celler er gjort med nybakte isolerte celler i primær kultur, eksplantering kulturer fra gnagere, eller semi-intakte smaksløkene i vev skiver 1,2,3,4. Selv om hver av disse preparatene har fordeler, ville utviklingen av langsiktige kulturer har gitt betydelige fordeler, særlig for studier av smak celleproliferasjon og forskjellerrentiation. Flere grupper, blant annet vår, har vært interessert i utvikling og etablering av smak cellekultur modeller. De fleste forsøk på kultur smak celler har rapportert begrenset levedyktighet, med celler vanligvis ikke varige utover 3-5 d 5,6,7,8. Vi har nylig rapportert om en vellykket metode for den utvidede kultur gnager smak celler 9. Vi her rapporterer for første gang etableringen av en in vitro kultur system for isolerte menneskelige fungiform smak papiller celler. Celler fra menneskelig fungiform papillae fremstilt ved biopsi ble vellykket opprettholdt i kulturen for mer enn åtte passasjer (12 måneder) uten tap av levedyktighet. Celler vist mange molekylære og fysiologiske egenskaper som kjennetegner modne smak celler. Gustducin og fosfolipase C β2, (PLC-β2) mRNA ble oppdaget i mange celler ved revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon og bekreftet av sekvensering. Immunocytochemistry analyse viste tilstedeværelse av vindkastducin og PLC-β2 uttrykk i dyrkede smak celler. Dyrkede humane fungiform celler også utstilt økninger i intracellulært kalsium i respons til passende konsentrasjoner av flere smaks stimuli som tyder på at smak reseptorer og minst noen av de signalveier var til stede. Disse resultatene indikerer at tilstrekkelig smak celler fra voksne mennesker kan genereres og opprettholdes i minst åtte passeringer. Mange av cellene beholder fysiologiske og biokjemiske egenskaper akutt isolerte celler fra voksne smak epitelet til å støtte deres bruk som en modell smak system. Dette systemet vil gjøre det mulig videre studier av de prosessene som er involvert i spredning, differensiering og funksjon av mammalske smak reseptor celler i en in vitro forberedelse.
Menneskelig fungiform smak papillae brukt for å opprette menneskelig fungiform cellekultur ble donert til forskning etter riktig informert samtykke under forskning protokoller som ble anmeldtog godkjent av IRB komiteen. Protokollen (# 0934) ble godkjent av Schulman Associates Institutional Review Board Inc., Cincinnati, OH. Skriftlig protokoll nedenfor er basert på publiserte parametere som rapporteres av Ozdener et al. 2011 10.
Protocol
Discussion
Vi har opprettholdt celler hentet fra menneskers fungiform smak papillae i over åtte passeringer, som spenner over en periode på 12 måneder. Disse kulturene generere nye celler, hvorav mange forfall in vitro til det stadiet der de uttrykker flere markører med moden smak knoppen celletyper, i tillegg til viktige molekylære og fysiologiske egenskaper smak reseptor celler. Tilstedeværelsen av gustducin-og PLC-β2 immunoreaktivitets i undergrupper av dyrkede celler er i samsvar med denne konklusjonen. Viktigs…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Aimee Myers og Esi Quayson for tekniske ferdigheter og hjelp. Dette arbeidet ble støttet delvis av NSF 0216310 og Givaudan Inc stipend (NER).
Materials
| Name of the reagent | Company |
| MCDB 123 | Sigma-Aldrich |
| Iscove’s DMEM Medium | MediaTech |
| Elastase | Sigma-Aldrich |
| Pronase E | Sigma-Aldrich |
| Elastase | Worthington |
| Soy bean trypsin inhibitor | Worthington |
| Collagenase type 1 | Worthington |
| Rat tail collagen type 1 | BD Sciences |
| Fura-2 AM | Molecular Probes |
| Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen |
| Leica TCS SP2 Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems Inc. |
| Discovery-1 imaging station and Metamorph software | Molecular Devices |
| Small fine-tip forceps and extra fine spring scissors | Fine Science Tools |
Riferimenti
- Mbiene, J. P., Maccallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. J. Comp. Neurol. 377, 324-340 (1997).
- Miyamoto, T., Fujiyama, R., Okada, Y., Sato, T. Strain difference in amiloride-sensitivity of salt-induced responses in mouse non-dissociated taste cells. Neurosci. Lett. 277, 13-16 (1999).
- Caicedo, A., Jafri, M. S., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. J. Neurosci. 20, 7978-7985 (2000).
- Qin, Y. M., Shi, J. Q., Zhang, G. H., Deng, S. P., Wang, T. H. A reliable method to obtain cells of taste buds from fungiform papillae of mice. Acta Histochem. 112, 107-112 (2010).
- Spielman, A. I., Mody, I., Brand, J. G., Whitney, G., MacDonald, J. F., Salter, M. W. A method for isolating and patch-clamping single mammalian taste receptor cells. Brain Res. 503, 326-329 (1989).
- Kishi, M., Emori, Y., Tsukamoto, Y., Abe, K. Primary culture of rat taste bud cells that retain molecular markers for taste buds and permit functional expression of foreign genes. Neuroscienze. 106, 217-225 (2001).
- Ruiz, C. J., Stone, L. M., McPheeters, M., Ogura, T., Bottger, B., Lasher, R. S., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Maintenance of rat taste buds in primary culture. Chem. Senses. 26, 861-873 (2001).
- Stone, L. M., Tan, S. S., Tam, P. P., Finger, T. E. Analysis of cell lineage relationships in taste buds. J. Neurosci. 22, 4522-4529 (2002).
- Ozdener, H., Yee, K. K., Cao, J., Brand, J. G., Teeter, J. H., Rawson, N. E. Characterization and long-term maintenance of rat taste cells in culture. Chem. Senses. 31, 279-290 (2006).
- Ozdener, M. H., Brand, J. G., Spielman, A. I., Lischka, F. W., Teeter, J. H., Breslin, P. A., Rawson, N. E. Characterization of Human Fungiform Papillae Cells in Culture. Chem. Senses. 36, 601-612 (2011).
- Gomez, G., Rawson, N. E., Hahn, C. G., Michaels, R., Restrepo, D. Characteristics of odorant elicited calcium changes in cultured human olfactory neurons. J. Neurosci. Res. 62, 737-749 (2000).
- Wolozin, B., Sunderland, T., Zheng, B. B., Resau, J., Dufy, B., Barker, J., Swerdlow, R., Coon, H. Continuous culture of neuronal cells from adult human olfactory epithelium. J. Mol. Neurosci. 3, 137-146 (1992).
- Wick, N., Saharinen, P., Saharinen, J., Gurnhofer, E., Steiner, C. W., Raab, I., Stokic, D., Giovanoli, P., Buchsbaum, S., Burchard, A., Thurner, S., Alitalo, K., Kerjaschki, D. Transcriptomal comparison of human dermal lymphatic endothelial cells ex vivo and in vitro. Physiol. Genomics. 17, 179-192 (2007).
- Fu, L., Zhu, L., Huang, Y., Lee, T. D., Forman, S. J., Shih, C. C. Derivation of neural stem cells from mesenchymal stemcells: evidence for a bipotential stem cell population. Stem Cells Dev. 17, 1109-1121 (2008).
- Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297, H1-H7 (2009).
