Parasite Induced Genetisch Angetrieben Autoimmune Chagas-Herz-Krankheit in der Hähnchen-Modell

1. Das Wachstum der Parasiten Wachsen trypomastigote Formen von T. cruzi Berenice und die β-Galactosidase-exprimierenden Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 in murinen Muskelzellen (L6) in Dulbecco Minimal Essential Medium mit 10% FSB, 100 IU / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 250 nM L-Glutamin (pH 7,2) kultiviert, 5% CO 2 bei 37 ° C Die frei schwimmenden trypomastigotes im Überstand Medium wurden verwendet, um Hühnereiern inokuliert. Wachsen Leishmania brasiliensis (Lb) LTB300 Lager in DMEM mit 20% FBS gezüchtet. Die Promastigoten Lb Form in der exponentiellen Wachstumsphase wurde verwendet, um Eier 9 inokulieren. 2. Parasite Inokulation in befruchtete Hühnereier Impfen eine Suspension von 100 T. cruzi trypomastigotes in 10 ul Kulturmedium durch eine 2-mm-Durchmesser-Loch in der Eierschale auf der Oberseite der Luftkammer der BühneX fruchtbaren Eier. Die Invasion und Vermehrung der virulenten Parasiten in den Embryo-Zellen werden in Video-S1 gezeigt. Die Kontrollgruppen sind wie folgt: a) die Kontrolle Hühner, b) Mock-Kontrolle Eier erhalten 10 ul Kulturmedium, c) Phase X fruchtbaren Eier mit einer Suspension von 100 lb Promastigoten in 10 ul Kulturmedium beimpft T.. cruzi und Lb gehören zu der Familie kinetoplastid. Beziehungsweise, wachsen diese Protozoen im Zytoplasma oder in parasitophoren Vakuole von Wirtszellen 10 frei. Verschließen Sie Löcher mit Klebeband. Inkubieren Sie die T. cruzi-infizierten Eiern und Mock und nichtinfizierten Kontrollproben bei 37,5 ° C und 65% Luftfeuchtigkeit für 21 Tage. Halten der Küken, die in dem Inkubator für 24 h schlüpfen und danach bei 32 ° C für drei Wochen. 3. Den Erhalt einer Probe zur DNA-Extraktion Periphere mononukleäre Zellen wurden von Hühnern erhalten: a)geschlüpften von T. cruzi beimpften Eier, b) Kontrollen; c) spottet erhalten 10 ul Kulturmedium, d) aus Lb beimpften Eier ausgebrütet; Weiße Blutkörperchen von Hühnern werden zur DNA-Extraktion nach einem Standardprotokoll 11 verarbeitet. Extraktion von DNA auch aus Samen von Hähnen und aus unbefruchteten Eizellen (<5 mm) von Hühnern aus Eiern geschlüpft geimpft mit T. gesammelt gesammelt cruzi, und von Hennen aus Kontrolle Eier 3, 4 geschlüpft. Auszug aus dem KDNA T. cruzi epimastigote bildet und auch, aus Lb Promastigoten, wie anderswo beschrieben 9. 4. Primer und Sonden verwendet Die Primer für die PCR-Amplifikationen und die thermischen Bedingungen sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Sonden in Southern-Blot-Hybridisierungen verwendet wurden, waren: Wildtyp-Minicircle (~ 1,4 kb) Sequenzen PuriFied von T. cruzi epimastigote Formen; Minicircle Fragmente (362 bp) von Nsi erhielt ich verdaut von Wildtyp-KDNA; Kern-DNA (nDNA) repetitive Sequenz (188 bp) durch Amplifikation der DNA mit den Parasiten Tcz1 / 2 Primern erhalten. Die Sonden wurden aus 1% igen Agarosegelen 3 gereinigt. Wildtyp-Minicircle (~ 0,820 kb) Sequenzen aus Lb Promastigoten. 5. PCR-Analysen Führen Sie Standard-PCR-Verfahren mit genomischer DNA aus infizierten und nicht infizierten Küken Kontrollen und verspotten mit T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 13 und KDNA s35/s36 Primer. Außerdem laufen PCR mit genomischer DNA aus infizierten Hühnern aus Lb-Eier unter Verwendung der spezifischen Lb3 Protozoen und LB5 Primer (Tabelle 1) geschlüpft. Make-Reaktionsmischung mit 100 ng Matrizen-DNA, 0,4 uM von jedem Paar von Primern, 2 U Taq DNA Polymerase, 0,2 mM dNTP und 1,5 mM MgCl <sub> 2 in einem 25 ul Endvolumen. Set Thermocycler für 95 ° C für 5 min, 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 95 ° C/30 Sekunden bei 68 ° C / 1 min bei 72 ° C mit 5 min abschließende Extension vor der Kühlung. Analysieren der Amplifikationsprodukte in 1,3% Agarose Gel, das auf eine positiv geladene Nylonmembran (GE Life Sciences) durch das alkalische Verfahren zur Hybridisierung mit spezifischen Sonden, die mit übertragen wird [α-32 P] dATP unter Verwendung von Random Primer Labeling Kit (Invitrogen , Carlsbad, CA). 6. Genomische Southern-Blots Verwendung Mbo I und / oder mit Eco RI (Invitrogen) Enzyme, die einzelnen Schnitte in Miniringe in DNA-Proben von Körpergewebe berücksichtigt worden. Digest-DNA aus nicht infizierten Kontrolle Hühner und Eier von Hühnern aus mit virulenten T. geimpft geschlüpft cruzi bildet. Vorbehaltlich der Verdau der DNA aus T. cruzi undvom Huhn Proben für die Elektrophorese in 0,8% Agarosegel bei 50 V über Nacht bei 4 ° C Übertragen aufgetrennten DNA-Banden auf positiv geladene Nylonmembran. Hybridisieren die DNA-Banden mit radioaktiv markierten Sonde KDNA. Waschen der Membran zweimal für 15 min bei 65 ° C mit 2 × SSC und 0,1% SDS, zweimal für 15 min bei 65 ° C mit jeweils 0,2 × SSC und 0,1% SDS und Autoradiographie für variable Zeiträume. 7. Gezielte Prime TAIL-PCR Erhalten Verstärkung des KDNA in der Hühner-Genoms durch eine modifizierte TAIL-PCR-Technik, die KDNA Primer hybridisiert mit Primer-Sets 2 integriert Minicircle drei Fuß-in Zyklen PCR wurde, wie in 1 gezeigt. Primarstufe: Jede Reaktion beinhaltet 200 ng Template-DNA, 2,5 mM MgCl 2 und 0,4 uM KDNA Primer (S34 oder S67), 0,2 mM dNTPs, 2,5 U Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA). Verwenden Sie die KDNA Primer in Kombination mit 0,04 um von Gg Primer (GG1 zu GG6, Tabelle 1), getrennt. Set Temperaturen von 57,9 bis 60,1 ° C KDNA Primer und 59,9 bis 65,6 ° C für CR-1-Primer. Beachten Sie, dass diese Temperaturen höher sind als die (~ 45 ° C), die für den willkürlichen degenerierten Primern in der PCR TAIL-10 verwendet. Verwenden Sie Temperatur und Zyklen (MyCycle Thermocycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) in einer früheren Arbeit 3 beschrieben. Sekundärkreislauf: verdünnen PCR-Produkte aus primären Zyklus 1:40 (v / v) in Wasser. KDNA Primern S35 und S35 Antisense ersetzt die vorherigen, zusammen mit den gleichen Primern Gg. Tertiär-Zyklus: verdünnen PCR-Produkte aus Sekundärkreislauf 1:10 (v / v) in Wasser und kombinieren Gg Primer mit S67 oder S36 Antisense, getrennt. Klonen der PCR-Produkte tertiären Zyklus: Clone direkt in pGEM T easy-Vektor (Promega, Madison, WI)die Produkte der letzten Verstärkung, dass mit KDNA Sonde hybridisieren. Wählen Klone durch Hybridisierung mit Sonde und KDNA Sequenz. Bestätigen Sie die tpTAIL-PCR in einer Mischung aus 300 pg KDNA von T. cruzi mit 200 ng DNA aus Kontrolltieren nie KDNA ausgesetzt. Die Temperatur und Amplifikationszyklen sind für die Prüfung Vögel DNA verwendet. 8. Chagas-Krankheit Klinik Manifestation Überwachen von Wachstum und Entwicklung von Hühnern aus T. geschlüpft cruzi infizierte Eier und von gesunden Kontrollpersonen aus nicht infizierten Eier täglich für Mortalität und wöchentlich für Krankheitsmanifestationen geschlüpft. Detect klinische Auffälligkeiten in diesen Hühnern (Abbildung 2) und machen Elektrokardiogramm (EKG)-Aufnahmen, um die elektrischen Achsen, Herzfrequenzen und Arrhythmien 3 zu bewerten. Betreff KDNA-mutierten Hühnern und steuert monatlich zu EKG-Aufzeichnungen von Augmented ventrikuläre unipolar führt aVF (linkes Bein), aVL (linker Arm), und AVR (rechter Arm), und auf mittlere Abweichung der elektrischen Achse nach links, die suggestive der Herzvergrößerung 3 ist zu beurteilen. 9. Pathologie und immunchemischen Analysen Rekord Herz und Körpergewicht Indizes nach natürlichen Tod von KDNA mutierten Hühnern (Abbildung 3). Erhalten Indizes auch für Steuerung Hühner des gleichen Alters und Geschlechts. Nehmen Abschnitte aus dem Herzen, Ösophagus-, Darm-, Skelettmuskel-, Lungen-, Leber und Nieren. Fix Gewebe in gepufferter 10% Formalin (pH 7,4), in Paraffin einbetten und schneiden bis 4 um dicke Schnitte für die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und histologische Analysen (Abbildung 3). Ernte-und bisect Gewebe von Embryonen aus Eiern mit Parasiten Ausdruck β-Galactosidase geimpft, und vorbehaltlich der X-Gal-Färbung geschlüpft. 9 Befestigen Sie die andere Hälfte der Embryo in ein Gewebe0% Formalin, pH 7,4 und gehen Sie wie in Schritt 9.3. Cut 4 &mgr; m dünnen Paraffin eingebettete Gewebeschnitte und montieren auf Objektträger für die mikroskopische Untersuchung. Inkubieren Abschnitten zeigt X-Gal-gefärbten blauen Zellen mit menschlichen chagasic Antiserum (1:1024 Verdünnung) gegen Anti-T. cruzi-Antigens. Waschen Abschnitte Nu mit PBS, pH 7,4, 5 min jeweils. Blaufärbung Zellen in den Geweben durch Embryos zweite Inkubation mit Fluorescein-konjugiertem Kaninchen-Anti-Human-IgG. Waschen Sie Abschnitte mit PBS (Schritt 8), mount mit Deckglas und beobachten Sie die blauen Zellen Licht-grün nach Prüfung unter UV-Licht bei 502 nm Wellenlänge, 200-facher Vergrößerung, für kolokalisierendes T. cruzi in Embryo-Zellen. 10. Phänotyp Immunsystem-Zellen in Herz-Läsionen Phänotyp Immunsystem Effektoren Zellen in Gewebeschnitten des Herzens von KDNA-positiven und von der Steuerung KDNA-negativen Hühner. Setzen Sie die Dias mitGewebeschnitt in Paraffin bei 65 ° C für 30 min eingebettet, um Wachs zu früheren Vorlage in vier Wäschen in 100% bis 70% Xylol und dann in absolutem Ethanol schmelzen PBS für jeweils 5 min. Spülen Sie die Folien in destilliertem Wasser, der Luft trocknen lassen, und behandeln mit spezifischen monoklonalen Antikörpern (Fluorescein-oder R-Phycoerythrin-konjugierten monoklonalen Antikörpern) aus SouthernBiotech, Birmingham, AL erhalten. Verwenden Sie die Maus-Anti-Huhn Bu-1 (Bu-1 a-und Bu-1 b-Allele, Herr 70-75 kDa) Mab AV20 zu monomorphe Determinante auf dem B-Zell-Antigene von Inzucht Hühner erkennen. Verwenden Sie die Maus anti-CD45 Huhn, Ig-Isotyp IgM1 κ spezifischen Huhn Thymus Abstammung Zellen (Mr 190 bis 215-kDa-Variante). Verwenden Sie die Maus-Anti-Huhn TCRγδ + (90-kDa Herr Heterodimer) Mab spezifischen Thymus abhängig CD8α + T-Zellen. Verwenden Sie die Maus-Anti-Huhn Mab CD-8-spezifischen Huhn α-Kette (Mr 34 kDa)-ten erkennene CD8-Zellen in Thymozyten, Milz, Herz und anderen Geweben. Verwenden Sie die Maus-Anti-Huhn KuL01 ausschließlich erkennen Monozyten / Makrophagen des Phagozytensystem. Waschen der Objektträger dreimal mit 0,1 M PBS, pH 7,4, jeweils 5 min nach der Inkubation mit spezifischen Anti-Phänotyp-Antikörper für 90 min in einer feuchten Kammer. Montieren Sie die Folie mit gepuffertem Glycerin für Prüfung unter Fluoreszenz-Mikroskop mit Emissions-Filter der Wellenlänge 567 und 502 nm, auf rote und grüne Fluoreszenz-markierten Zellen (Abbildung 4) zu erkennen. 11. Daten-Analysen Verwenden Sie das Huhn-Genom-Datenbank ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) für BLASTn Sequenz-Analysen. Verwenden Sie CLUSTALW Ausrichtungen, um E-Wert Partituren zu bestimmen. Setzen Sie dafür die GIRI wiederholen Maskierung Algorithmus CENSOR ( http://girinst.org/censor/index.php ) für die Lokalisierung der verschiedenen Klassen von Wiederholungen, chimäre Sequenzen. Verwende die Kinetoplastiden Einfügen und Löschen Sequenz Search Tool (KISS), um mögliche gRNAs in den KDNA Sequenzen zu identifizieren, mit Hilfe von WU-blastn-modifiziertem Matrix 3. Verwenden Sie T. cruzi Sequenzen http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas zu suchen-in gRNAs in den KDNA-Wirts-DNA-Chimären. 11,6) Verwendung des Student-t und die Kolmorov-Smirnov-Tests jeweils zu signifikanten Unterschiede zwischen den Abweichungen der elektrischen Achsen und zwischen Herz / Körpergewicht Indizes in den Versuchs-und Kontrollgruppen erhalten erfassen und zu erkennen Sterblichkeitsraten signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen von Hühnern ausgebrütet von T. cruzi inoculated Eier und von den Kontrollen. 12. Repräsentative Ergebnisse Die Impfung von 100 virulenten T. cruzi trypomastigotes in die Luftkammer des fruchtbaren Hühnereier nicht reduziert signifikant die Verhältnisse der Küken lebendig. Etwa 60% schlüpfen gesunde Küken und 40% können Embryo Verflüssigung oder Embryo Tod beim Schlupf zu unterziehen. Die überlebenden Küken behalten KDNA Minicircle Sequenz im Genom integriert. Es wird jedoch erwartet, dass einige Küken wird mit Kardiomegalie und Misserfolg in den Wochen nach dem Schlüpfen sterben. Die übrigen Küken wird nach außen gesunden Erwachsenen wachsen. In allen Phasen des Lebens die DNA aus Blut mononukleäre Zellen extrahiert wird nachgeben PCR-Amplifikation von KDNA, aber nicht nDNA. Die gezielte-Prime-TAIL-PCR 3, 4 Produkte, die geklont werden und die Sequenz zeigt die KDNA hauptsächlich Miniringe in kodierenden Regionen Makrochromosomen 1 bis 5 integriert. Die Hühner zeigen mehrere KDNA integrations in Genen, die für Zellwachstum und Differenzierung, Regulation des Immunsystems Faktoren und DNA-Reparatur sind Kandidaten für die Ablehnung der Selbst Zielgewebe (Abbildung 3) zu unterziehen. Zum Beispiel ist das Huhn zeigt KDNA Mutation mit Ruptur des Dystrophin-Gens (Abbildung 5), Codierung ein Protein, das Zytoskelett bindet an die Zellmembran, ein Kandidat für Autoimmun-inflammatorischen Kardiomyopathie und Scheitern zu entwickeln. Diese genomischen Veränderungen sind nicht in Lb infizierten Küken aus Eiern geschlüpften gesehen. Es gibt Unterschiede zwischen T. cruzi und Lb KDNA Miniringe; Die T. cruzi k DNA Minicircle durchschnittlich 1,4 kb Struktur mit vier variablen Region (VR) von konservierten Regionen (CR) mit jeweils CSB1, CSB2 und CSB3 Regionen, in denen CA-reiche DNA gebogen bestimmte Websites für die Initiierung der Replikation berücksichtigt werden, Transkription durchsetzt, Rekombination und zur seitlichen DNA-Transfer <sbis> 3, 4. Im Gegensatz dazu enthält das Lb KDNA Minicircle (durchschnittliche Größe 820 bp) durch einzelne CR VR gefolgt. CR hat CSB1 (GGGCGT) und CSB2 (CCCCGTTC)-Blöcke, die sich von denen in der T. sind konserviert cruzi Miniringe 15, 16 und 17. Anbetracht dessen, dass Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) zeigt 12 NTS Homologie zu dem T. cruzi ist es denkbar, dass entweder die Lb KDNA Minicircle in einem viel niedriger Frequenz, die nicht sichtbar sein kann durch die Techniken verwendet werden, oder dass es möglicherweise nicht in der Hühner-Genoms überhaupt integrieren integriert. Grundierung Ziel-DNA Reihenfolge Tm * S 34 T. cruzi KDNA 5 'ACA CCA CCA ATC ACC GAA CC 3' 57,9 S 67 T.cruzi KDNA 5 'TTT GGT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3' 60,1 S 35 T. cruzi KDNA 5 'ATG-ATA-TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3' 59,4 S 36 T. cruzi KDNA 5 'ATT GGT TCG GGG GTT GGT G 3' 57,9 Lb3 Lb KDNA 5 'GGG GGT GTA GTT-ATA-TAG TGG G 3 " 55,9 LB5 Lb KDNA 5 'CTA ATT GTG GGG CAC GAG G 3' 61,4 Gg 1 Gallus gallus 5 'AGC TGA TCC TAA AGG AGC CAG 3' 60,1 GG2 G. gallus 5 'TGC CTG AGC CTCTTT GAA A 3 ' 56,8 Gg3 G. gallus 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3 " 60,1 GG4 G. gallus 3 'GCT CTG CCT TTA GGA GCT TCA 5' 64,2 GG5 G. gallus 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' 62,3 GG6 G. gallus 3 'CTG TTA GCA TGA GGC TTC ACA A 5' 60,4 Tabelle 1. Primes in den PCR-Amplifikationen verwendet. * Tm = mittlere Glühtemperatur ° C. Abbildung 1. Der tp TAIL-PCR-Strategie verwendet, um Trypanosoma cruzi KDNA Integration in das Gallus-gallus-Genom zu erkennen. A) Eine chimäre Sequenz mit einem Fragment von KDNA Minicircle konservierten (dunkelblau) und variable (hellblau) Regionen im Locus NW_001471687.1 auf Chromosom 4 (AY237306) des Genoms Huhn 10 (grün) integriert wurde verwendet, um den Host zu erhalten spezifische Primer-Sets (GG1 bis GG6). B) Die tp TAIL-PCR-Amplifikationen wurden initiiert (Primarstufe) durch Glühen der Minicircle-spezifischen S34 oder S67 Primer in Kombination mit den Hühner-spezifischen Primer GG1 bis GG6. Das verwässerte Produkte bereitgestellten Vorlage für die Sekundarstufe mit der S35 (Sense / Antisense-) Primer und den Kombinationen der Primer Gg. In der tertiären Zyklus eine Verdünnung der Nebenprodukte wurde Amplifikation mit KDNA S36 oder S67 Antisense-Primer in Kombination mit dem Primer unterzogen Ggs. C) Die Amplifikationsprodukte wurden in 1% Agarosegelen aufgetrennt und auf eine Nylonmembran, hybridisiert mit der spezifischen Sonde KDNA. Proben, die positives Signal für die Klonierung wurden verwendet, um den Punkt der Integration zu bestimmen. Die Kombinationen von KDNA und gezielte GG1 bis GG6 sind auf der Oberseite des Gels gezeigt. Die sequentielle PCR-Reaktionen amplifizierten Ziel-Host KDNA DNA-Sequenzen mit KDNA Miniringe (blau) und der Vogel-Sequenz (grün). (Nachdruck aus PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Abbildung 2. Klinische Manifestationen auf eine Beeinträchtigung der Herzfunktion in einem 9-Monate altes Huhn genetisch durch die Integration der mitochondrialen KDNA geändert von T. Minicircle cruzi. Der arme Blutoxygenierung der mitochondrialen KDNA Huhn mutiert, die eine lila Kamm kontrastiert mit der leuchtend roten Kamm der Steuerung 9-Monate alten chicken frei von Schädigungen des Herzens. (Geändert von PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Abbildung 3. Gross und mikroskopische Pathologie in Gallus-gallus mit KDNA Mutationen. A) Kardiomegalie in einem 9-Monate alte Henne, die an Herzversagen gestorben. B) Kontrolle Herz von einer nicht infizierten 9-Monate alte Henne. C) Ablehnung der Herzfrequenz Zellen durch cytotoxische Lymphocyten: Eine minimale Abhalteeinheit mit Lyse der Zielzellen durch Immunlymphozyten dargestellt (Kreis). D) Kontrolle Herzen Histologie (Geändert von PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Abbildung 4. Immunzytochemische Analysen der Zellen des Immunsystems infiltriert das Herz KDNA-mutierten Huhn in Abbildung 3 dargestellt. A) CD45 +-Lymphozyten identifiziert (Pfeile) im Herzen leEmissionen von einem Phycoerythrin-markierten spezifischen monoklonalen Antikörper. B) CD8 + γδ Immunsystem Lymphozyten (Pfeile) in schweren Zerstörung des Herzens beteiligt sind. C) Reichlich CD8α + T-Zellen präsentieren in schweren Läsionen mit Herz Zelllyse. Die Einsätze zeigen die Abwesenheit von Zellen des Immunsystems bei der Kontrolle nicht infizierten Huhn Herz (Geändert von PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Abbildung 5. Chagas-wie dilatative inflammatorischen Kardiomyopathie in einem F2-Nachkommen mit KDNA Integration im Dystrophin-Gen. A) Herzerweiterung in einem 10-Monate altes Huhn besetzen die meisten der Brusthöhle (Herzgewicht = 16 g). B) dunkle runde mononukleären Zellen infiltriert und zerstört das Myokard des KDNA-mutierten Henne. C) Normale Herz-Größe (Gewicht 7 g) eines 10-Monate altes Huhn Kontrolle. D) der normalen Histologie einer Kontrolle Huhn Herz. (Geändert von PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Abbildung 6. Vergleichende Pathologie in KDNA-Huhn mutiert und in der menschlichen Chagas-Krankheit. A) Schwere Myokarditis und Herzfrequenz Zelllyse in der KDNA-mutierten Huhn. B) Schwere Myokarditis und Ziel Zelllyse durch das Immunsystem Lymphozyten in einem Fall, der Chagas-Herzkrankheit. C) Die Ablehnung von Herzzellen durch Immun-Lymphozyten in der KDNA-mutierten Huhn. D) Die Ablehnung von Herzzellen durch Immun-Lymphozyten im menschlichen Chagas-Krankheit. Gefärbt durch Hämatoxilin und Eosin. (Modifiziert nach Memórias tun Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 14).