1. MFIA Prosedür açıklaması (Şekil 1) MFIA Charles River antijen kaplı polistiren mikroküreler (boncuk), test serumu, etiketli reaktifler (BAG, SPE) ve tamponlar (İlköğretim Dilüent, Assay buffer) gerektirir. Tepkin maddeler 96-filtre-alt mikrotitrasyon levha kuyuları ile adım adım eklenmiştir. Heterojen bir testi anlam inkübasyonlar reaktifleri ilişkisiz serum bileşenleri kaldırmak için filtre yıkama adımları takip veya etiketli olarak MFIA gerçekleştirilir. Yıkama çözeltisi boncuk korumak iyi filtre-dipleri aracılığıyla aspirasyon tarafından kaldırılır plaka kuyucuklara eklenir. MFIA deneyleri, oda sıcaklığında (27 ° C + / -2 ° C) gerçekleştirilir. Test serum inkübasyon adım sırasında oluşan antijen-antikor komplekslerini R-fikoeritrin-işaretli streptavidin (SPE) tarafından takip biotinlenmiş keçi anti-tür konjugatları (BAG) ile inkubasyon ile tespit edilir. Tahlil okuyucu içinde, boncuk her seferinde bir tane geçirmekiki lazerler maruz bir detektör. Bir lazer bir deneyde karşılık boncuk renk kümesi tanımlamak iç boyalar heyecanlandıran, diğer tahlil sırasında yakalanan fikoeritrin muhabiri boya heyecanlandırıyor. Boncuklar bir önceden belirlenmiş sayıda deney başına okunur ve fikoeritrin floresans yoğunluğunu bir medyan Flüoresans endeksi (MFI) olarak rapor edilir. Şekil 1. MFIA Prosedürü. Xmap tabanlı MFIA antijenleri (veya kontrol) kovalent bağlı olduğu renk kodlu polistiren 5.6 mikron boncuk kullanan bir süspansiyon mikroarray olduğunu. Boncuklar 100 ayrı bir renk kümesi gelir beri boncuklar bir vakumlu manifold üzerindeki aspirasyon ile yıkandı, böylece, 100 kadar farklı testler filtre-alt mikrotiter plakalar içinde gerçekleştirilen, tek bir iyi Assay adımda gerçekleştirilebilir. Tepkiler Luminex Xmap 100 florimetre ile okunur. Phycoeryt yoğunluğuhrin floresans medyan floresan indeksi (MFI) olarak rapor edilir 2. Başlarken önce aşağıdaki hususlara dikkat ediniz: MFIA boncuklar duyarlı ışık Doğrudan ışığa maruz kalma miktarını sınırlayan önemlidir. Rutin testler sırasında oluşan ışığa maruziyet normal miktarı kabul edilebilir ama uzun süreli maruz Testi okuyucu tarafından okunamaz hale boncuk photobleaching yol açabilir. Bu MFIA boncuklar her zaman (10-30 saniye) kullanmak için önce süspansiyon içine vortekslenerek sonra sonicated olduğunuz testin başarısı için çok önemlidir. Testi okuyucu sadece tek boncuk gelen bilgileri toplar. Toplulaştırılmış boncuk kümeleri artık kez okundu yol açabilir. Tahlil çözümler buharlaşma önlemek için tüm İnkübasyon sırasında plakası kapak ile kaplı Test plakası tutmak için emin olun. Gerekli Kişisel Koruyucu Ekipman: Laboratuvar mont, gllaboratuvar ortamında çalışırken oves ve göz koruması her zaman giyilmelidir. 3. Reaktifler Tablo 1, bir in-house MFIA laboratuvar kurmak için gerekli malzemelerin çoğu içerir. Ek veya yinelenen öğeler özel ihtiyaçlarına bağlı olarak gerekli olabilir. Bu envanter Charles River (MFIA boncuk, kontroller ve ek reaktifler) satın reaktifler dahil olmadığını lütfen unutmayın. Biotinlenmiş konjugatları ve streptavidin etiketlendi fikoeritrin çeşitli ticari kaynaklarında bulunmaktadır. Ancak Charles River edinilebilir reaktifler alternatif satıcıları veya reaktif sürü kullanarak, bizim reaktifleri ile gürültü skoru optimal sinyal verecek şekilde titre edilmiştir tavsiye edilmez. Tablo 1. CR-RADS BioRad ve Biotek gelen otomatik mikroplak yıkayıcı bir Bioplex Süspansiyon Dizi Okuyucu kullanır. Eşdeğer enstrümantasyon alternatif satıcıları edinilebilir. <tbody> Madde Satıcı Katalog Numarası Ekipman Süspansiyon dizi okuyucu * BioRad 171-000205 96 çukurlu bir mikrolevhadaki yıkayıcı Biotek ELX50/8FMW Ultrasonik temizleyici / banyo Cole Palmer EW0884900 Analog vorteks karıştırıcı VWR 58816-121 -20 ° C derin dondurucu Çeşitli 4 ° C'de soğutma cihazı Çeşitli 12-kanallı pipet, 20-200μl VWR 83009-718 Orbital plaka çalkalayıcı VWR / Lab-Line 57019-600 Ipuçları Tek kanallı pipet, 20-200μl, VWR 83009-732 Ipuçları Tek kanallı pipet, 2-20uL, VWR 83009-726 Ipuçları Tek kanallı pipet, 100-1000μl, VWR 83009-736 Vacushield havalandırma cihazı VWR 55095-006 Vakum basınç pompası VWR 54908-037 Vakum sistemi atık haznesi VWR 80200-640 Sarf 96-polystryrene plaka Fisher Scientific 14-245-145 MultiScreen HTS-BV plaka, 1.2μm filtresi, stiren Millipore MSBV N12 50 15ml konik tüpler (polipropilen) Sarstedt 62554.002 50ml konik tüpler (polipropilen) Sarstedt 62547.004 Serum şişeleri Sarstedt 72694.007 Alüminyum folyo VWR 89079-068 1L şişeleri, steril VWR 28199-246 0.22μm şişe üstü filtreler VWR 28199-307 Reaktif rezervuar (100ml) VWR 82026-356 Sıvı reaktifler dağıtımı için 5ml, 10ml, 25ml pipetler VWR Reaktifler PBS, pH 7.4 1 BSA, tozu (poşet) Sigma P3813 ProClin 300 Sigma / Supelco 48912-U Mikroküreler Kaplanmamış Luminex türüne göre değişmektedir 4. Reaktif Hazırlama İki tamponlar MFIA işlem için gereklidir. Birincil Dilüent Charles River mevcuttur ve non-spesifik protein etkileşimleri azaltmak için özel bloke edici ajanlar içerir. Test yıkama tamponu ticari olarak mevcut reajanlardır ile tesis yapılır. Test Yıkama tamponu: PBS /% 1 BSA, pH 7.4, Sigma-Aldrich bir toz olarak kullanılabilir. Parçacık tahlil okuyucu tıkanmasına neden olabilir gibi süzme ile, partikül kaldırılmasını önemlidir. Steril, etiketli kaplara bir 0.2micron şişe üstü filtre ünitesi ile tampon filtreleyin. BAG ve SPE Assay Yıkama tamponu kendi 2X çalışma konsantrasyonu seyreltilir. Not: SPE ışığa duyarlı ve sh olduğunuould sınırlı ışık pozlama var. 5. Örnek Hazırlanması Sizin test materyalleri, reaktifler ve disposables birleştirin. Çoklu ve tek kanallı mikropipetler ve ipuçları 96-düşük protein bağlama mikrotiter plakalar (serum dilüsyon) ve filtre-alt plakalar (MFIA assay) Standart prosedüre göre kan örnekleri toplayın. Tam santrifüj ve serum kaldırılmadan önce en az 30 dakika boyunca oda sıcaklığında onları tutarak pıhtı kan örneklerinde izin verin. Undilute serum örneği alınmasından önce serum bileşenlerini karıştırmak için kısaca vortekslenerek olmalıdır. MFIA için son test dilüsyon 1/50 olduğunu. Bu tahlil için, test serum bir 2X (1/25) örnek yapmak için gereklidir. 24 parça MFIA İlköğretim Dilüent serum 1 kısım ekleyerek sulandırılmamış test serumu seyreltin. Bir 96-kuyu mikrotiter plaka test serum Organizasyonu büyük ölçüde tes için örnekler arasında aktarma süresini kısaltırt plaka ve şiddetle tavsiye edilir. 6. Testi Plaka Hazırlık 96-Test plakası Ön-ıslatma uygun, hatta iyi tahliye sağlamak için gereklidir. Tüm plaka bu adım gerekli olan ilk olarak kullanılmaz bile, sonradan reaktif eklemek ya da hazneyi ile tampon yıkama için gerek kalmaz. Bazı laboratuvarlar test plakasına ve daha sonraki bir tarihte bu kuyuların yeniden kullanmak planı üzerinde kullanılmayan kuyuları mühürledi tarafından tam 96-plaka daha az çalıştırın. Biz Test plakası uygun filtrasyon etkileyebilir beri bu yöntemi kullanmanızı tavsiye etmiyoruz. Uygun test plakasına aspirasyon MFIA testin başarısı için çok önemlidir. Örnek kuyuların Tahliye yaklaşık 5-10 saniye sürer. Çok hızlı bir şekilde iyi içeriği Çekiş Testin sonunda, damla toplama ve yavaş okuma kez yol açabilir. Her w sonra kağıt havlu ile test plakasının alt Blotsıvı drenajı sağlamak için kül adım durdu. Test plakası leke uyulmaması Keçi anti-tür ve / veya türler IgG boncuk puanları başarısız kuluçka ve sonuç sırasında kuyulardan esneklik sıvı reaktifler yol açabilir. Bu boncuk birincil serum ve etiketlenmiş reaktiflerin uygun miktar her bir oyuğa ilave edilir, önceden belirlenmiş bir aralık içinde MFI skor şekilde tasarlanmıştır. 7. MFIA Boncuk Süspansiyon Hazırlama Bu boncuklar her zaman vortekslenerek kullanmadan önce sonicated olduğu testin başarısı için çok önemlidir. Tahlil okuyucu sadece tek boncuk gelen bilgileri toplar, boncuk toplamları veya kümeleri uzun defa okundu yol açabilir. Vorteks stok birleştiğinde boncuk süspansiyonu (tipik olarak 10 ± 5 saniye) 10-20 saniye için bir sonikatör banyosunda sonikasyon takiben boncuklar yeniden süspanse edin. İlköğretim Dilüent bir 2X çalışan boncuk süspansiyon 20X stok süspansiyon seyreltin. 2X boncuk süspansiyonu 50μl dağıtınıslatılmalı Testi Plate de her bir deney için. 8. Testi Plate Test ve Kontrol Sera eklenmesi Her 2X test edin ve önceden tanımlanmış plaka haritası dayalı Testi Plaka serum Kontrol Pipet 50μl. Elastik bir bant veya alüminyum folyo ile plaka ve oda sıcaklığında karanlıkta orbital çalkalayıcı üzerinde 60minutes için Test Plakası inkübe Güvenli kapak. Çalkalayıcı hızı 400 den büyük ama 700Rpm az olmalıdır. Bu boncuklar serum antikorları birleştiğinde antijenlerin tüm yüzeyleri erişimine izin vermek için askıya tutulması önemlidir. Boncuk askıya tutmakta başarısız düşük IgG boncuk kontrol puanları neden olur ve tahlil tekrarlanması gerekir. 9. Testi Tabak Yıkama Bir vakum manifoldu kullanılarak iyice içeriğini aspire. Örnek kuyuların Tahliye yaklaşık 5-10 saniye sürer. Pape ile deney plakasının alt Blotsıvı drenajı sağlamak için her türlü sonra r havlu durdu. Test yıkama tamponu 50μl olarak boncuklar yeniden süspanse edin. Bu boncuk tahlil işlem sırasında kurumasına izin verilmemesi önemlidir. 10. Testi Plate BAG ve SPE ekleme MFIA boncuklar içeren tüm kuyulara 2X çalışma seyreltme BAG 50μl dağıtın. Elastik bir bant veya alüminyum folyo ile plaka kapağı sabitleyin. Oda sıcaklığında, karanlıkta, yukarıdaki gibi sallama ile 30 dakika için test plakasına inkübe edin. Bu inkübasyon Testi Plaka yıkayın ve önceden serum ilavesinden sonra açıklandığı gibi Assay Yıkama tamponu ile tekrar süspansiyon boncuk sonra. MFIA boncuklar içeren tüm kuyulara 2X çalışma seyreltme SPE 50μl dağıtın. Elastik bir bant veya alüminyum folyo ile plaka kapağı sabitleyin. Oda sıcaklığında, karanlıkta, yukarıdaki gibi sallama ile 30 dakika için test plakasına inkübe edin. Bu incu sonrabation Testi Plaka yıkayın ve Assay Yıkama tampon 125μl ile boncuklar tekrar süspansiyon ve önceki tahlil okuyucuya yerleştirerek boncuklar tekrar süspansiyon ~ iki dakika plakası sallayın. 11. Testi Plaka Okuma Boncuk resuspending 10 dakika içinde test okuyucu test plakasına yerleştirin. Bir elektrik kesintisi veya başka bir olay durumunda, Test Plakası 12 saate kadar okumak için hazır olana kadar karanlıkta oda sıcaklığında saklanabilir. Seçilen boncuk paneli testi kuyularda boncuk profil eşleştiğini doğrulamak için de ilk örnek gözlemleyin. Protokol ekranda onların belirleyeceği 'boncuk bölgenin dışında kalan boncuklar varsa, yanlış bir profil seçimi yapılmadı. Boncuk düzgün süspanse edilmiş ise onlar girmeniz gerekir tahlil okuyucu yazılımı belirtilen kendi Belirtilen 'bölgeler'. Boncuklar toplanır Eğer onlar yavaş tesisindeki bölgelerinde dolduracakoranı. Siz okuyucu testi plaka kaldırmak ve el kuyular tekrar süspansiyon yapabilirsiniz. Boncuk agrega kırma yardımcı olmak için bir çok kanallı pipet 3-4 kez her iyi Karışım. Okuyucu testi plakasını değiştirin ve devam edin. 12. Temsilcisi Sonuçlar Boncuklar bir minimum sayıda deney başına okunur ve fikoeritrin floresan yoğunluğu 0 ila 32.667 arasında değişen bir ortalama floresans endeksi (MFI) olarak rapor edilir. 25 sayıları karşılaştırarak sonra, kuyu başına 50 veya 100 boncuk biz anlamlı bir fark gördüm ve rutin de numune başına ajan başına 25 boncuk saymak. Örneğin yetersiz boncuk sayım veya IgG / anti-IgG boncuk puanları başarısız gibi hatalar için sonuç raporu inceleyin. Bu boncuk birincil serum ve etiketlenmiş reaktiflerin uygun miktar her bir oyuğa ilave edilir, önceden belirlenmiş bir aralık içinde MFI 'skor' için tasarlanmıştır. Hataları ile örnek kuyu, (düşük boncuk sayım) veya başarısız IgG kontrolü boncuk puanları gerekirgeçerli sonuçlar elde etmek için tekrarlanır. Bir Excel çalışma sayfasına sonuçları aktarın. Bizim veri yorumlama için her bir deney atanır: Bir Doku Kontrolü (TC) Testi: En kemirgen MFIA testlerde, doku, kontrol vahşi tip bakülovirüs-enfekte böcek hücreleri bir özüdür. Bir Assay Cutoff: Bu değer, beklenen minimum floresans ve tanısal doğruluğu artırmak için her bir deney için ayarlanır. Çoğu testlerde, floresans cutoff 3000. Ortalama net Flüoresans endeksi (MFI) aşağıdaki formül ile her bir deney (doku ve IgG kontrol testleri dışında) için hesaplanmıştır. Diğer bir deyişle, söz konusu test sinyalinin sadece 0-32 yerine 0-32,667 arasındaki net MFI aralığını belirler toplam tahlil MFI eksi TC (geri plan) MFI Bu değer daha sonra 1000 ile ayrılır. Net MFI = (MFI Antikor Testi – MFI Doku Kontrolü) / 1000 Net MFI ve TC MFI her antijen için spesifik Test Kesim kıyasla puanları dönüştürülür. Şekil 2. Hepsi IgG ile test serumu için Örnek MFIA veri geçirerek denetler. 12.4 MFIA Yorumlama Sistem Uygunluk Kontrolü ve Serum Kontrolü (IgG / anti-IgG boncuk) sonuçları Tablo 2'de listelenen kabul kriterleri karşılamak durumunda Testi Plakalı sonuçlar yorumlanmalıdır. Bu iki IgG kontrol boncuk Başarısızlık böyle uygunsuz seyreltme veya yetersiz miktarda konjuge veya bir immunocomprimised hayvandan serum SPE, yanlış testi serum seyreltme veya kullanımı gibi birçok usul hataları gösterebilir. Tablo 2 Assay Kontroller için Kabul Kriterleri Kontrol </td> Memnuniyet Sonucu Skor Sınıflandırma Yüksek Menzil İmmün Serum ≥ 4,5 Olumlu Düşük Menzil İmmün Serum ≥ 1.5 ≥ Borderline Non-immün serum <2.5 ≤ Borderline Seyreltici <2.5 ≤ Borderline Ig Boncuk * Set ≥ Cutoff/1000 Geçmek * Boncuk türe özgü anti-testi serum immunglobulin (Ig) ile kaplı ayarlayın: Bu örnek uygunluk denetimi için başarısız puanları çok yüksek, yetersiz numune ilavesinden neden olabilecek bir immünyetmezligi ho bir seyrelme, yanlış tür veya test serumust. Testi Plate Test Kontrolleri herhangi Yüksek Oranda Bağışıklık Serum dışında başarısız olursa, sonuç kabul edilemez ve tekrar edilmelidir. O Test plakası algılama hassasiyet seviyesi göstermektedir yana geçen Düşük aralık Serum kontrol puanları önemlidir. Keçi anti-IgG tür boncuk skor tahlil eklendi birinci deney serum miktarına dayanmaktadır. Bu denetim boncuk başarısız ama türler IgG (Eh B1, Şek.3) geçerse o kadar test reaktifleri (BAG, SPE) de test eklenmiştir gösterir ve bu serum ile ilgili bir konudur. Test reaktifleri miktarı, belli bir yetersiz ise IgG ve anti-IgG kontrol boncuklar hem başarısız (Eh E1, Şek.3) olacaktır. Şekil 3. Başarısızlıkları ile Örnek MFIA test sonuçları (turuncu gösterilir). Wells A1, C1 ve F1 TC (doku reaktif) arıza belirtisiburada TC skoru parantez içinde gösterilir. Wells B1 ve E1 IgG iç kontrol hataları, yetersiz testi antikor (B1) veya BAG / SPE sırasıyla test reaktifleri (E1) iki tür göstermektedir. Deney plaka deneyinde kontrol sonuçlar tatmin edici ise Tablo 3'te gösterildiği gibi, bireysel tahlil skorları sınıflandırılır. Bu alternatif bir test yöntemi, herhangi bir sınırda ya da pozitif bir bulgu onaylamak için çok önemlidir. Tablo 3 MFIA Puan Sınıflandırma Skor Sınıflandırma TC Net TC + Net * ≥ 2 <0.5 <2.5 Negatif (-) <td> ≥ 0.5 ≥ 2,5 Reaksiyon TC (T) <2 negatif
