XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

1. Kısa dönemli insan antijenine spesifik CD8 T hücre çizgilerinin 7 üretimi Ficoll-Paque Plus, kullanılarak normal sağlıklı HLA-A2 pozitif vericiden alınmış kanda ayrı periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC). 2 x 10 6 hücre / ml 'de 6-kuyucuğu 2 ml / PBMC ekleyin. HLA-A2 bağlayıcı HER-2/neu p369-377 peptidi (amino asit dizisi KIFGSLAFL) veya HLA-A2 bağlayıcı grip 10 ug / ml ve yerine bir nihai konsantrasyonda direk oyuklara P58-66 peptid (GILGFVFTL) ekleyin % 5 CO 2 ile 37 ° C'de bir inkübatör. Kültür ortamı içinde 50 birim / ml 'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için: uyarmak ve genişletme T hücreleri, ekleme, rekombinant insan IL-2 (50 ünite / ml stok) ile desteklenmiş her 2 günde bir, 250 ul / çukur taze ortam yardımcı olmak için. Yeniden canlandırmak aynı peptitler 10 ug / ml 'si ile 2 saat süre ile doldurulan 2 x 10 6 hücre / ml' ışınlanmış otolog PBMC ile kültür hücreleri kullanırAdım 1.3 ve ilk peptit uyarımından sonra 1 ml / oyuk az bir hafta kültür, bu hücrelerin eklemek d. Gibi mevcut kültürleri her 2 günde bir halinde, Aşama 1.4 'de tarif rekombinant insan IL-2 ve taze ortam ekleyin. İkinci peptit uyarımından sonra 1.5 bir hafta, Adım A'da açıklandığı gibi, peptit ve ışınlanmış otolog PBMC ile hücrelerin yeniden uyarır. Altı gün erken yeniden stimülasyon son sonra hücrelerin kullanımı hazırlayın. 2. Meme Kanseri Hücrelerinin Hazırlanması % 5 CO 2 ile 37 ° C'de bir inkübatör XCELLigence empedans ölçüm istasyonu (XCELLigence istasyonu) yerleştirin. % 0.25 tripsin ve santrifüjleme (5 dakika boyunca 1000 rpm) ile% 75 konfluent Hasat insan tümör hücreleri (SKBR3, BT20, MCF7 veya HCC1419). Hemasitometre ve RPMI tümör medya sulandırmak bunların (% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 500 birim / ml ile takviye edilmiş kullanılarak tümör hücre sayımı7.5 x 10 3 tümör cells/100 ml 'lik bir konsantrasyonda, IFN-gama). Iyi düzeni belirlemek için düzeni sayfa kurarak ve empedans okumaları bir 40 saat süreyle her 5 dakikada çekmek için zamanlama sayfa kurarak Programı XCELLigence yazılımı. İlk 18 saat için, XCELLigence sistem sadece tümör hücrelerinin empedansı okuma alacaktır. XCELLigence E-plakaları, RPMI ortamı tümör 100 ul ekleyin ve hücrelerin yokluğunda empedans ölçerek okuma bir arka plan gerçekleştirin. XCELLigence istasyonu iyi ve yeri başına 100 ul, E-plakalara tümör hücreleri ekleyin. Hemen E-plakaları bağlı kalarak başlar tümör hücrelerinin, empedans okuma alarak başlamak için XCELLigence yazılım start düğmesine basın. 3. CD8 T hücreleri ile tümör ko-kültürü Tümör hücrelerinin x 10 4 tümör hücreleri de ortalama (yakla bağlı ve 1.5 katına sonralaşık 18 saat başlangıçta) kaplama olduktan sonra, hasat T hücreleri nazik kazıma ve ajitasyon ile Bölüm 1 hazırlanan 5 dakika için 1000 rpm'de santrifüj ve 40 T hücrelerine 1 tümör hücresi azami oranında başlayarak, çeşitli oranlarda% 10 FBS ile bir hemasitometre ve RPMI ortamı içinde sulandırın onları T hücrelerinin sayısı ve bir oranına kadar 2 kat seyreltilir 1.25 T hücrelerine 1 tümör hücresi ulaşılır. Örneğin, göz başına 1.5 x 10 4 tümör hücreleri bulunmaktadır. Bir 01:40 oranı elde etmek için, çukur başına 6 x 10 5 T hücreleri ekleyin ve 2-kat oyuk başına 1,875 x 10 4 T hücreleri (1:1.25 oranında) ile 1.5 x 10 4, tümör hücrelerinin bir oranına kadar T hücreleri seyreltik elde edilir. XCELLigence istasyonu duraklatmak ve E-plaka kaldırmak. Bir pipet ile kuyularda Ortamı çıkarın ve 200 ul tek başına ortam veya çukurlara T hücreleri uygun bir oranda ilave edin. XCELLigence istasyonunda E-plaka geri yerleştirin ve XCELLigence yazılım yanlısı devamgram kadar empedans okuma T hücresi ilave edildikten sonra, yaklaşık 20 saat boyunca her 5 dakikada bir alınır. Testin sonunda sonuçlar normalize. 4. Krom Sürüm Testi (MKK) 7 51 Cr ve 51 Cr-etiketli hedef hücreleri ile çalışırken kurumsal radyasyon güvenlik prosedürleri izleyin. Her zaman radyasyona maruz kalma azaltmak için uygun koruyucu kullanın. Darbe tümör 1 ile 2 saat boyunca hücre x 10 10 ul / ml yeni, 51 Cr (0,005 Ci / ml) olan 6 tümör hücre / ml. 5 dakika için 1000 rpm'de% 10 FBS ve santrifüj ile RPMI ortamı 10 ml tümör hücreleri yıkayın. 100 ul / oyuk içinde 1 x 10 5 tümör hücreleri, 96-çukurlu yuvarlak tabanlı bir plaka tümör hücreleri ekleyin. 40 T hücrelerine 1 tümör hücresi başlayarak çeşitli oranlarda T hücreleri, ekleme ve 1.25 T hücrelerine 1 tümör hücresinin bir oranına kadar 2 kat seyreltilir elde edilir. Örneğin, 1 x 10 5 tümör hücreleri vardır de başına. Bir 1:40 oran elde etmek için, çukur başına 4 x 10 6 T hücreleri ekleyin ve 2 kat, oyuk başına 1.25 x 10 5 T hücreleri (1:1.25 oran) 1 x 10 5, tümör hücrelerinin bir oranına kadar T hücreleri seyreltik elde edilir. Plaka spontan ve maksimum tümör hücre denetimleri ekleyin. Tümör hücreleri 51 Cr spontan salım hesaplamak için, her birinde 1 x 10 5 tümör hücreleri,% 10 FBS ile RPMI ortam ul 100-100 ul altı kuyu ekleyin. Tümör hücreleri 51 Cr maksimum serbest hesaplamak için, 100 ul ile 100 ul% 0.1 Triton tüm hücreleri lyses PBS, X-100, altı kuyu Her biri 1 x 10 5 tümör hücreleri ekleyin. % 5 CO2 ile 37 ° C de 5 saat süre ile inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, her oyuktan 50 ul süpernatan kaldırmak ve Luma plakaya ekleyin. Gece plakaları kurulayın ve Gama Sayaç kullanarak CPM ölçün. le "> 5. Yüzde Lizis Hesaplama Empedans deneyi: Çeşitli zaman noktalarında hücre indeksi (CI) olarak rapor empedans okuma, alın ve yüzde lizizi belirlemek için, aşağıdaki formülle hesaplanır: (CI tümör yalnızca – (CI tümör + T hücreleri)) / (yalnızca tümör CI) * 100. MKK: yüzde lizis belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın: (CPM deneysel – CPM spontan) / (CPM maksimum – CPM spontan) * 100. 6. Temsilcisi Sonuçlar Tek başına T hücreleri empedans artışı yok T hücreleri genel olarak, en katı yüzeyler için uygun olmayan ve aktivasyonu ve proliferasyonu için yapışma gerekmez. Bu nedenle, T-hücreleri XCELLigence E-plakaları empedansın katkı gerektiği varsayılmıştır. Bunu test etmek için, kuyulara SKBR3 göğüs kanseri hücreleri ya taze saflaştırılmış insan CD8 T hücreleri ya ile yüklendi. Empedans 40 saatlik ders ve bir temsili örnek demonst üzerinde ölçüldüT hücrelerinin değerlendirme esas az etkisi Şekil 1A 'de gösterilmiştir. Buna karşılık, sadece biraz da olsa T hücreleri, arka plan empedans azaltabilir söylenebilir. Buna karşın, ko-kültür empedans ölçümlerinin başlamasının ardından 18 saat süre ile T hücrelerinin ekleme işlemi bir empedans bozulması (Şekil 1B) ile sonuçlandığını ortaya koymuştur. Diğer çalışmalar aksamalar inkübatör iç aynı sinyal olarak azalma yana taşıma kısmen T hücresi içeren çözelti bu sıcaklıkta sağlanması ile azaltılabilir bağlı olduğu olduğunu ortaya çıkarmıştır. T hücreleri tarafından aracılık edilen empedans azalmalar doza bağlıdır. Sitotoksik T-hücre aktivitesi için örnekler karşılaştırmak için bir empedans bazlı tahlil programı antijen-spesifik T hücrelerinin farklı konsantrasyonları arasında ayrım yapmak yeteneğini gerektirir. Bu mümkün olup olmadığını test etmek için, SKBR3 hücreleri konsantrasyon değişen ortak kültür vardıT-hücreleri T hücre hattı lar bir HER-2/neu özgü p369 türetilmiştir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, empedans azalmalar T hücrelerinin doza bağımlı idi. Şekil 2B 10 saat sonra, hücre endeksi T hücrelerinin aralığı üzerinde basit bir ikinci dereceden polinom izleyin. Böylece, XCELLigence istasyonu hücre indeksi bir düşüş olarak gerçek zamanlı olarak SKBR3 tümörlerin CD8 T hücre aracılı ölümü izler. Empedans tabanlı tahlil, antijene özel T hücreleri tespit Bir HER-2/neu ve HLA-A2 pozitif meme kanseri tümör hücre hattı, SKBR3 empedans azalmalar, HER-2/neu tarafından p369-spesifik T hücrelerinin antijen olup olmadığını belirlemek için, SKBR3 ihtiva eden özel, ayrı kuyu da kuluçkalanmıştır Bir influenza (grip)-spesifik T hücre hattından alınan T-hücreleri ile. GRİP spesifik T hücrelerinin HLA-A2 pozitif olmak, bir non-spesifik kontrol olarak görev yaptı, ama HER-2/neu tanımak için herhangi bir yeteneğine sahip değil. Fi 'de gösterildiği gibifigür 3, FLU-spesifik T hücreleri (p <0.0001) ile karşılaştırıldığında, p369-spesifik T hücrelerinin HER-2/neu litik aktivitesi arasında önemli bir fark yoktur. Bazı durumlarda, tümör spesifik olmayan T-hücreleri (örneğin, FLU-spesifik veya anti-CD3/anti-CD28 uyarılmış) litik aktivitesi (Şekil 3A-B), düşük bir seviyede gösterdi. T hücreleri ya non-spesifik olarak Fas ile, iki yoldan birini öldürebilir: Fas ligand etkileşimleri veya antijen-özellikle granzymes ve perforins serbest bırakılması ile. Daha HER-2/neu-specific T hücreleri bir antijen belirli bir şekilde öldürülmesi olduğu kavramı teyit etmek için, Fas ligandı için bir blokaj antikor dahil edilmiştir. Şekil 3B 'de gösterildiği üzere, antikor, HER-2/neu p369-spesifik T hücrelerinin litik aktivite azaltmadı. Antikor olarak anti-CD3/CD28 boncuklar ile non-spesifik olarak aktive olan T hücreleri ile gösterdi Fas ve Fas Ligand arasındaki etkileşimler, inhibe olabilir. Bu sonuçlar zamanTümör-spesifik T hücrelerinin tümör olmayan spesifik T hücreleri ile test edilir, Fas ligandı blokajı az olmayan bir TCR aracılı etkileşimi azaltmak için gerekli olabilir. Alternatif olarak, kısa süreli kültürlenmiş T hücreleri hatları kullanıldığında T hücrelerinin sadece bir kısmını ex vivo olarak üretimi için kullanılan bir antijen için spesifik olduğu, MHC uyumsuzluk aracılı T-hücresi aktivasyonunun olasılığı spesifik olmayan liziz, yol meydana gelebilir. Bu durumda, alakasız HLAS bloke eden antikorların eklenmesi gerekli olabilir. P369-spesifik T hücrelerinin I bağımlı bir şekilde, ya da bir anti-HLA sınıf I veya antikor izotip kontrol antikoru ko-kültür ilave edildi, bir HLA sınıf tümör hücrelerini öldürerek olup olmadığını belirlemek için. Gibi p369-spesifik T hücreleri, Şekil 3C, lizis gösterilen HLA sınıf I sınırlama gösteren antikoru dahil edilmesi ile bastırılmıştır. Bu tahlilin geliştirilmesi büyük ölçüde SKBR3 kullanılarak yapıldı yana Son olarak, bu tespit etmek için, diğer yapışık HLA-önemliydiA2 ve HER-2/neu ifade tümör hücrelerinin p369-spesifik T hücreleri tarafından öldürülmüş olabilir. Bu nedenle, T hücreleri hazırlandı ve HLA-A2 ve HER-2/neu-expressing tümör hücreleri, SKBR3, MCF-7 ve HCC1419 hücreleri 1:5 oranında eklendi. HLA-A2 negatif tümör hücre hattı, BT20 bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Gibi BT20 dışında Şekil 3B, bu ek tüm tümör hücrelerinde de gösterildiği ayrıca şu şekilde empedans ile değerlendirildi öldürüldü. Dolayısıyla, yöntem yapışık birden fazla hedef tümör hücreleri için yararlı olduğu görülmektedir. Empedansı bazlı analiz sitotoksik T hücre aktivitesini saptamada standart krom salınım testi daha hassastır Sitolitik aktivite ölçer krom (51 Cr) salınım testi (MKK) uzun CD8 T hücre yanıtlarını izlemek için hangi altın standart olmuştur. Bu deneyde, hedef hücreler (örneğin, tümör hücreleri) 51 Cr ile etiketlenir. Çoğu durumda, sağlıklı bir hedef hücrelerin çoğunluğu tutabilentahlil boyunca radyoaktif. CD8 T hücrelerinin genellikle değişen konsantrasyonlarda da hedef hücreleri ilave edildi ve hedef hücreleri öldürme ortam içine 51 Cr açıklaması ile tespit edilir. Kenara tehlikeli radyasyon kullandığı gerçeğinden, MKK ile iki önemli sorun duyarlılık eksikliği ve tahlil genellikle kendi programını sınırlayıcı, CD8 T hücrelerinin büyük miktarda gerektirir. Empedans tabanlı tahlil, etiketlenmemiş tümör hücreleri ya da bunları içeren standart bir polipropilen plakalar içeren E-plakaları ya da için değişen miktarlarda, MKK, HER-2/neu p369-spesifik T hücreleri, in vitro ve in Applied oluşturulan daha duyarlı olup olmadığını belirlemek için 51 Cr-etiketli hedef hücreler. Ölçümler, empedansı ya da serbest ya da krom, T hücresi ilave edildikten sonra 5 saat sonra ölçüldü. Şekil 4, temsili bir örnek, empedans tahlil krom salınım daha iyi performans gösterir. Içi varyasyonempedansı bazlı tahlil tipik olarak% 20 dir. Bu testin daha geniş kullanımı büyük ölçüde tekrarlanabilir ve değişimi (Şekil 5) ile belirlenecektir beri test içi varyasyon, incelendi. İki p369-spesifik T hücre çizgileri 30 gün ara ile bağımsız bir şekilde üretilir ve T hücre oranları tümör hücresi, bir dizi üç kopya halinde ilave edildi. Hatları SKBR3 hücreleri parçalama bölgesinin açısından büyük ölçüde eşdeğer olduğu Şekil 5 'de ilave grafiğini gösterir. Varyasyon% katsayısı, her hücre oranı hesaplanır ve çizilmiştir. 01:40 ve 01:05 oranları arasında, Şekil 5'te gösterildiği gibi varyasyon (CV)% katsayıları altında% 15 idi. 1:2.5 ve 1:1.25, ancak, CV yüksek ya da önceden tahmin edilemeyen edildi. Çünkü geniş bir biyolojik varyasyon, bu primer T hücresi çizgileri ile inter-analiz varyabilitesi ölçmek mümkün değildir. <br /> Şekil 1. Empedans T hücrelerinin ilave edildikten sonra normalize edilmesi gerekmektedir. Panel A: tümör hücreleri (kırmızı çizgi) ve olmayan T hücreleri (mavi çizgi) empedansı sorumlu olduğunu göstermektedir. Tek başına tümör veya T ya hücreleri için 40 saat boyunca empedans iz vardır gösterilir. Benzer sonuçlar, ikinci bir deneyden elde edilmiştir. . Yaklaşık 20 saat sinyali pertürbasyon tümör hücreleri içermeyen çukurlara T-hücreleri ilave noktasını temsil eden bir B Paneli Not: empedans ölçümleri geçici olarak tümör hücreleri, T hücrelerinin yanı sıra ile kesintiye olduğunu göstermektedir. Bu, T-hücreleri ilave edildikten sonra bir zaman noktasında (grafikte işaretlenmiştir normalleştirme alanına bakınız) normalleştirme gerektirir. İzler yinelenen veri noktalarından oluşmaktadır. Tek başına tümör hücreleri ile ilgili izleme kırmızı renkte gösterilmiştir. 1.25 T hücreleri / yeşil tümör hücre oranı: diğer izleri tümör hücreleri HER-2/neu p369-spesifik T hücrelerinin (Mavi ile ortak-kültürlenir temsil eder:) hücre / tümör 40 T hücrelerinin oranı. Her eser kültür süresi boyunca her 5 dakikada toplanan yinelenen veri noktaları hesaplanır. Toplam 3 ayrı deney temsilcisi vardır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 2. T hücreleri tarafından aracılık edilen empedans azalma doza bağımlıdır. Panel A: O Gösterildiği SKBR3 tümör hücrelerinin empedansı izleri tek başına ya da tümör-spesifik T hücrelerinin farklı konsantrasyonlarda inkübe edilir. Her iz kültür süresi boyunca her 5 dakikada bir toplanan veri noktası üç kopya hesaplanır. Toplam 3 ayrı deney temsilcisi olan Panel B:. Hücre / tümör hücre konsantrasyonları tüm T genelinde 10 saat hücre endeksleri olan Gösterilmektedir. Noktalı çizgi, tümör hücreleri al hücre dizini temsil edenbir. Her sembol üçlü belirlemeli ortalama (± SEM) olduğunu. Toplam 3 ayrı deney temsilcisi vardır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 3,. Empedansı bazlı analiz antijene özgü sitotoksik T hücre yanıtları algılar. Panel A, HER-2/neu ko-kültürü takiben p369-spesifik T hücrelerinin (Kırmızı) veya grip-özel T 5, 10 hücreleri (Mavi), ve 15 saat SKBR3 hücrelerinin lizisi düzeyini gösterir. Her veri noktası üçlü ölçümün ortalaması (± SEM) olduğunu. Sonuçlar 3 ayrı deney için temsili bulunmaktadır. Panel B, antijen-spesifik parçalanma, Fas-Fas ligand etkileşimleri nedeniyle değil gösteren, p369-özgü T hücreleri veya non-spesifik olarak aktive T hücreleri tarafından SKBR3 parçalanması gösterir. Siyah çubuklar ortak kültürleri temsilBir antikorun Fas ligandı içermektedir. Her bir çubuk T hücrelerinin ilave edildikten sonra 5 saat sonra üç kopya halinde ortalama (± SEM) erimesidir. Sonuçlar 3 ayrı deney için temsili bulunmaktadır. Panel C, 10 saat p369-spesifik T hücreleri tarafından SKBR3 T hücresi ilave edildikten sonra lizis gösterir HLA sınıf I bağlıdır. HLA sınıf I engelleme veya izotip kontrol ya ko-kültür sırasında eklenmiştir. Her çubuk üç kopya halinde ortalama (± SEM) parçalanması olduğunu. Bu deney benzer sonuçlar ile iki kez tekrar edildi. Panel D 10 saat p369-spesifik T hücreleri tarafından birkaç HLA-A2 + HER-2/neu-expressing tümör hücre hatları T hücresi ilave edildikten sonra% lizis gösterir. BT20, bir HLA-A2-negatif meme kanseri hücre soyu, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Her nokta üç nüsha belirlenmesi ile hesaplanabilir benzersiz bir deney temsil eder. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . <img src = "/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg" alt = "Şekil 4" /> Şekil 4. Empedansı bazlı tahlil tümör antijen-spesifik T hücrelerinin saptanması için krom salınım tahlili daha duyarlıdır. Gösterilen tümör ve T hücre takip eden 5 saat sonra ölçüldüğü gibi p369-spesifik T hücrelerin, değişen konsantrasyonlarda tepki olarak SKBR3% 'si olan lizis empedansı bazlı analiz ve krom salınım testi her ikisini de kullanarak karıştırma. Her sembol üç ortalama (± SEM) çoğaltır olduğunu. Sonuçlar 3 ayrı deney için temsili bulunmaktadır. Şekil 5,. Empedans tabanlı T hücre sitotoksisite testi varyasyon% içi varyasyon katsayıları. Gösterildiği antijen-spesifik T hücrelerinin bir konsantrasyon aralığı üzerinde SKBR3 lizizi varyasyon ortalama (± SS)% intra-analiz katsayılarıdır. Her sembol çoğaltır üç ortalamasıdır. Grafikte gösterilen Numaraları t vardır% CV O anlamına gelir. ilave panel (± SEM, n = 3) p369-377-spesifik T hücrelerinin konsantrasyonları arasında değişen SKBR3% lizis demek gösterir. Iki farklı vericiden gelen T hücreleri kullanan iki bağımsız bir şekilde oluşturulan p369-spesifik T hücre çizgileri gösterilmektedir.