Определение оптимальной цитотоксической активности человека Her2neu специфических CD8 Т-клеток путем сравнения CR51 анализа высвобождения в системе xCELLigence

1. Генерация Краткосрочные человека антиген-специфических CD8 Т-клеточных линиях 7 Отдельные мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из крови нормальных здоровых HLA-A2-позитивных доноров, используя Ficoll-Paque плюс. Добавляют 2 мл / лунку РВМС в 6-луночные планшеты при 2 × 10 6 клеток / мл. Добавить HLA-A2-связывающий HER-2/neu p369-377 пептида (аминокислоты KIFGSLAFL последовательность кислота) или HLA-A2-связывающий гриппа p58-66 пептида (GILGFVFTL) непосредственно в лунки в конечной концентрации 10 мкг / мл и место в инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO 2. Для стимулирования и расширения Т-клеток, добавление, каждые 2 дня, 250 мкл / лунку свежей среде с добавлением человеческого рекомбинантного IL-2 (наличии: 50 единиц / мкл) до конечной концентрации 50 ед / мл в культуральной среде. Повторно стимулировать культуру клеток 2 × 10 6 клеток / мл облученных аутологичных МКПК импульсного течение 2 часов при 10 мкг / мл того же пептиды использоватьг на шаге 1.3 и добавить эти клетки культур со скоростью 1 мл / лунку одну неделю после первой стимуляции пептидом. Добавить человеческого рекомбинантного ИЛ-2 и свежей среде, как описано на стадии 1.4, в существующую культуру каждые 2 дня. Повторно стимулировать клетки с пептидом и облученных аутологичных МКПК как описано в шаге 1,5 одну неделю после второй стимуляции пептидом. Подготовки к использованию клетки шесть дней после последнего повторного стимулирования в ближайшее время. 2. Подготовка клеток рака молочной железы Поместите xCelligence измерения импеданса станции (xCelligence станция) в инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO 2. Урожай опухолевых клеток человека (SKBR3, BT20, MCF7 или HCC1419), которые составляют 75% сливной использованием 0,25% трипсина и центрифугированием (1000 оборотов в минуту в течение 5 минут). Граф опухолевых клеток с использованием гемоцитометра и восстанавливать их в среде RPMI опухоли (с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 500 ед / млIFN-гамма) в концентрации 7,5 × 10 3 опухолевых клеток/100 мкл. Программа xCelligence программного обеспечения путем создания макетов страниц, чтобы определить хорошо макета и задании расписания странице взять импеданс показания каждые 5 минут в течение 40-часового периода. За первые 18 часов xCelligence система примет импеданс показания опухолевых клеток только. Добавить 100 мкл среды RPMI опухоли xCelligence E-пластины и выполнять дополнительное чтение путем измерения импеданса в отсутствие клеток. Добавить опухолевых клеток к E-пластин при 100 мкл на лунку и место в xCelligence станции. Нажмите кнопку Пуск на xCelligence программное обеспечение, чтобы начать принимать импеданс показания опухолевых клеток, которые сразу же начать придерживаясь E-пластин. 3. Совместное культивирование опухоль с CD8 Т-клеток После того, опухолевые клетки придают и в два раза до 1,5 × 10 4 опухолевых клеток на лунку (приближенномерно через 18 часов после первоначально посевом), урожай T-клетки, полученные в разделе 1, осторожно соскоб и агитации Центрифуга при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут и считать Т-клеток с использованием гемоцитометра и восстанавливать их в среде RPMI среде с добавлением 10% FBS при различных соотношениях, начиная с максимальным отношением 1 опухолевых клеток до 40 Т-клеток и не разбавленный в 2 раза, пока соотношение 1 опухолевых клеток в Т-клетках 1,25 достигнута. Например, есть 1,5 × 10 4 опухолевых клеток на лунку. Для достижения 1:40, добавляют 6 × 10 5 Т-клеток на лунку и разбавить Т-клеток в 2 раза до соотношении 1,5 × 10 4 опухолевых клеток к 1,875 × 10 4 Т-клеток на лунку (соотношение 1:1,25) достигается. Пауза xCelligence станции и удалить E-пластины. Выньте материал в скважинах с пипеткой и добавить 200 мкл среды отдельно или соответствующего соотношения Т-клеток в лунки. Поместите E-пластину обратно в xCelligence станции и продолжить Pro xCelligence программного обеспеченияграмм так импеданс снимаются показания каждые 5 минут в течение приблизительно 20 ч после добавления Т-клеток. Осуществить нормировку результатов в конце анализа. 4. Хром анализа высвобождения (CRA) 7 Следуйте институциональные процедуры радиационной безопасности при работе с 51 Cr и 51 Cr-меченых клеток-мишеней. Всегда используйте соответствующие экранирование для уменьшения радиационного облучения. Импульсный опухолевых клеток в течение 2 часов при 1 × 10 6 опухолевых клеток / мл, 10 мкл / мл свежей 51 Cr (0,005 Ки / мл). Мытье опухолевых клеток в 10 мл среды RPMI среде с добавлением 10% FBS и центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут. Добавить опухолевых клеток в 96-луночных круглым дном планшет при 1 × 10 5 опухолевых клеток в 100 мкл / лунку. Добавить Т-клеток при различных соотношениях, начиная с 1 опухолевых клеток до 40 Т-клеток и не разбавленный в 2 раза до тех пор соотношении 1 опухолевых клеток в Т-клетках 1,25 достигнута. Например, есть 1 × 10 5 клеток опухоли на лунку. Для достижения 1:40, добавляют 4 × 10 6 Т-клеток на лунку и разбавить Т-клеток в 2 раза до соотношении 1 × 10 5 клеток опухоли до 1,25 × 10 5 Т-клеток на лунку (соотношение 1:1,25) достигается. Добавить спонтанных опухолей и максимальный контроль клетку к пластине. Для того чтобы вычислить спонтанное высвобождение из 51 Cr от опухолевых клеток, добавляют шесть лунок каждый из которых содержит 1 × 10 5 опухолевых клеток в 100 мкл в 100 мкл среды RPMI среде с 10% FBS. Чтобы рассчитать максимальный выпуск 51 Cr от опухолевых клеток, добавляют шесть лунок каждый из которых содержит 1 × 10 5 опухолевых клеток в 100 мкл в 100 мкл 0,1% Тритон Х-100 в PBS, который лизирует всех клеток. Инкубируйте пластин в течение 5 часов при 37 ° C с 5% CO 2. После инкубации удалить 50 мкл супернатанта из каждой лунки и добавить его в тарелку Luma. Высушите пластины на ночь и измерить CPM помощью гамма-счетчика. Le "> 5. Процент лизиса Расчет Сопротивление анализа: Возьмите сопротивление чтению, сообщил, что и ячейка индекс (СИ), в различные моменты времени и использовать следующую формулу для определения процента лизиса: (CI только опухоли – (CI опухоли + Т-клеток)) / (CI опухоли только) * 100. CRA: Используйте следующую формулу для определения процента лизиса: (CPM экспериментальные – CPM спонтанной) / (максимальный CPM – CPM спонтанной) * 100. 6. Представитель Результаты Т-клетки сами по себе не увеличивают сопротивление Т-клетки, в общем, не придерживаются самых твердых поверхностей и не требуют соблюдения для активации и пролиферации. Таким образом, было предположено, что Т-клетки не должны способствовать импеданса от xCelligence E-пластин. Чтобы проверить это, скважины были загружены или SKBR3 клеток рака молочной железы или только что очищенного человеческого CD8 Т-клеток. Сопротивление измеряли в течение 40 часов и представитель demonst примеррейтинг по существу небольшой эффект Т-клеток показано на фиг.1А. Напротив, можно утверждать, что Т-клетки могут уменьшиться фоне сопротивления, хотя и незначительно. Несмотря на это, совместной культуре показало, что процесс добавления Т-клеток через 18 ч после начала измерения импеданса привело к нарушению импеданс (фиг.1В). Другие исследования показали, что сбои были частично из-за обработки с уменьшением сигнала может быть уменьшена путем обеспечения того, температура Т-клеточный раствор, содержащий такой же, как внутренний инкубатора. Снижение сопротивления опосредованной Т-клеток зависит от дозы. Полезность сопротивлением на основе анализа сравнить образцы для цитотоксическую активность Т-клеток требует умения различать разные концентрации антиген-специфических Т-клеток. Чтобы проверить, что это возможно, SKBR3 клетки культивировали совместно с различной концентрациейных Т-клеток, полученных из HER-2/neu p369-специфических Т клеточной линии. Как показано на рисунке 2А, снижение импеданса зависит от дозы Т-клеток. Показывает Рисунок 2B, что клетка индексов на 10 часов следовать простым полиномом второго порядка в диапазоне Т-клеток. Таким образом, xCelligence станция контролирует CD8 Т-опосредованной смерти клетки SKBR3 опухоли в режиме реального времени в виде капли в камере индекса. Импеданс на основе анализа распознает антиген-специфических Т-клеток Чтобы определить, снижение сопротивления SKBR3, которая является HER-2/neu и HLA-A2-положительные опухоли рака молочной железы клеточная линия, по HER-2/neu p369-специфические Т клетки антиген-специфических отдельные лунки, содержащие SKBR3 также инкубировали с Т-клетками, полученными от гриппа (грипп) конкретных Т-клеточной линии. ГРИПП конкретных-Т-клеток служили неспецифические управлении, имеющих HLA-A2 положительно, но не имея никаких способность распознавать HER-2/neu. Как показано на Fiрисунке 3, существует значительное различие между литическую активность HER-2/neu p369-специфических Т клеток по сравнению с FLU-специфических Т клеток (р <0,0001). В некоторых случаях Т-клетки не специфичны для опухоли (например, грипп или конкретной anti-CD3/anti-CD28 стимулированный) показали низкий уровень литической активности (фиг. 3A-B). Т-клетки могут убить в одном из двух способов, либо неспецифически через Fas: Fas лиганд или антиген-в частности, путем выпуска и гранзимы перфорины. Для дальнейшего подтверждает о том, что Т-клетки HER-2/neu-specific убивали в антиген-специфической модой, мы включили блокирующих антител к лиганд ФАС. Как показано на фиг.3В, антитело не снижает литическую активность HER-2/neu p369-специфических Т-клеток. Антитела могут препятствовать взаимодействия между ФАС и Fas-лиганд, как показали с Т-клетками, которые были неспецифически активированных anti-CD3/CD28 бисером. Эти результаты показывают, что приопухоль-специфических Т-клеток, испытывают с неопухолевых-специфических Т-клеток, Fas-лиганд блокада может быть необходимо уменьшить не-TCR опосредованных взаимодействиями к минимуму. Кроме того, при использовании краткосрочных культивированный Т-клетки линии, в которых только часть Т-клеток, специфичных для антигена, используемого для генерации исключая виво, возможность MHC рассогласование-опосредованной активации Т-клеток может произойти, ведущих к неспецифическим лизиса. В этом случае, добавление антител, которые блокируют значения HLAs может быть оправдано. Чтобы определить, p369-специфических Т клеток убивать опухолевые клетки в класс HLA I зависимым способом, или антитело анти-HLA класса I или антитела изотипа контроль были добавлены в совместных культурах. Как показано на фиг.3С, лизис p369-специфических Т-клеток было подавлено путем включения антитело демонстрирует HLA класса I ограничений. Наконец, так как развитие этого анализа была в значительной степени осуществляется с помощью SKBR3, важно было выяснить, если другие приверженца HLA-А2 и HER-2/neu выражения опухолевых клеток мог быть убит p369-специфических Т-клеток. Таким образом, Т-клетки и добавляют в соотношении от 1:5 до HLA-A2 и клеток опухоли HER-2/neu-expressing, SKBR3, MCF-7 и HCC1419 клеток. HLA-A2-отрицательные опухолевых клеточных линий, BT20 был использован в качестве отрицательного контроля. Как показано на фигуре 3D, все эти дополнительные опухолевых клеток, за исключением BT20 также были убиты по оценке импеданса. Таким образом, способ может оказаться полезным для нескольких целевых прилипшие клетки опухоли. Импеданс на основе анализа является более чувствительным, чем стандартный анализа высвобождения хрома в обнаружении цитотоксических Т-клеточной активности Хрома (Cr 51) анализа высвобождения (CRA), который измеряет цитолитическую активность уже давно золотого стандарта с помощью которого можно контролировать CD8 Т-клеточные ответы. В данном анализе клетки-мишени (например, опухолевых клеток) метят 51 Cr. В большинстве случаев, здоровые клетки-мишени может сохранить большинстворадиоактивной метки в течение анализа. CD8 T-клетки добавляют к клеткам-мишеням, как правило, в различных концентрациях, и убивать клетки-мишени обнаруживается выпуск 51 Cr в среду. Помимо того, что он использует опасного излучения, две основные проблемы, связанные с CRA являются отсутствие чувствительности и то, что анализ обычно требует большого количества CD8 Т-клеток, что ограничивает его полезность. Чтобы определить, если импеданс на основе анализа был более чувствителен, чем CRA, HER-2/neu p369-специфические Т клетки были получены в пробирке и прикладной, в различных количествах, либо E-планшеты, содержащие немеченого опухолевых клеток или стандартные пластины полипропилена, содержащего 51 Cr-меченных клетках-мишенях. Измерения, либо сопротивление или свободного хрома, были измерены в 5 часов после того Т клетки. Рис. 4, а представитель, например, показывает сопротивление превосходит анализа высвобождения хрома. Внутри анализа измененияполного сопротивления на основе анализа, как правило, ниже 20%. Внутрисерийная изменения был рассмотрен, так как более широкое использование этого анализа будет в значительной степени определяется его воспроизводимым и вариации (рис. 5). Два p369-специфических Т клеточные линии были получены независимо 30 дней друг от друга и добавлены в трех экземплярах в диапазоне от опухолевых клеток в Т соотношения клетки. Вставка графика на рисунке 5 показано, что линии были в значительной степени эквивалентны с точки зрения SKBR3 лизиса клеток. % Коэффициент вариации был рассчитан для каждой ячейки соотношения и построены. Как показано на фиг.5, между 1:40 и 1:05 соотношении% Коэффициент вариации (КВ) были ниже 15%. На 1:2,5 до 1:1,25, однако, резюме были высокими или непредсказуемым. Из-за обширной изменение биологической, это невозможно измерить между анализами изменчивость с первичной Т-клеточных линий. <br /> Рисунок 1. Сопротивление должно быть нормализованы с последующим добавлением Т-клеток. Панель: показывает, что опухолевые клетки (красная линия), а не Т-клетки (синяя линия) несут ответственность за сопротивление. Показаны сопротивление обводка более 40 часов для любой опухоли или Т-клетки в покое. Аналогичные результаты были получены от второго эксперимента. Следует отметить, что сигнал возмущения примерно 20 часов представляет точку дополнение Т-клеток в лунки не содержащих опухолевые клетки Панель B:. Показывает, что сопротивление измерений временно нарушена с добавлением Т-клеток в опухолевых клетках. Это требует нормализации в некоторый момент времени точки с последующим добавлением Т-клеток (см. точку нормализации отмечены в графе). Следы состоят из дублирующихся точек данных. Трассировку для опухолевых клеток только отображается красным цветом. Другие следы представляют опухолевые клетки культивируют совместно с HER-2/neu p369-специфических Т клеток (Синий: Отношение 1,25 Т-клетки / опухолевую клетку, зеленый:Отношение 40 Т-клетки / опухолевых клеток). Каждая кривая вычисляется из дубликаты точек данных, собранных каждые 5 минут через продолжительность культуры. Результаты представителем 3 отдельных экспериментов. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 2. Снижение сопротивления опосредованной Т-клеток зависит от дозы. Панель A: Показаны импеданс следы SKBR3 опухолевые клетки инкубировали отдельно или с различными концентрациями опухоль-специфических Т-клеток. Каждая кривая вычисляется из трех экземплярах точек данных собирают каждые 5 минут через продолжительность культуры. Результаты представителем 3 отдельных экспериментов Панель B:. Указаны ячейки индексов на 10 часов во всех Т-клеток / опухолевых клеток концентрациях. Пунктирная линия представляет индекс ячейки для опухолевых клеток др.один. Каждый символ представляет собой среднее (± SEM) из трех определений. Результаты представителем 3 отдельных экспериментов. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 3. Импеданс на основе анализа распознает антиген-специфических ответов цитотоксических Т-клеток. Панель А показывает степень лизиса клеток SKBR3 HER-2/neu p369-специфических Т клеток (красный) или FLU-специфических Т клеток (синий) при 5, 10 и 15 часов после совместного культивирования. Каждая точка данных представляет собой среднее (± SEM) из трех измерений. Результаты являются репрезентативными три отдельных экспериментов. Панель В показывает лизиса SKBR3 по p369-специфических Т клеток или неспецифически активированных Т-клеток, демонстрируя, что антиген-специфического лизиса не связано с Fas-лиганд Fas взаимодействий. Черные полосы представляют совместно культур, чтосодержащиеся антител Fas лиганда. Каждый столбик представляет собой среднее (± SEM) лизис в трех экземплярах на 5 часов после добавления Т-клеток. Результаты являются репрезентативными три отдельных экспериментов. На панели С показаны лизис 10 часов после Т-клеток добавлением SKBR3 по p369-специфических Т-клеток является HLA класса I зависимыми. Либо HLA класса I блокировка или изотипического контроля был добавлен во время совместного культивирования. Каждый стержень среднего (± SEM) лизис в трех экземплярах. Этот эксперимент повторяли дважды с аналогичными результатами. Панель D показывает% лизиса 10 часов после Т-клеток добавлением нескольких HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing опухолевых клеточных линий на p369-специфических Т-клеток. BT20, HLA-A2-отрицательные клетки рака молочной железы линии был использован в качестве отрицательного контроля. Каждое пятно представляет собой уникальный эксперимент рассчитывается из трех определений. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . <img src = "/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg" alt = "Рисунок 4" /> Рисунок 4. Импеданс на основе анализа является более чувствительным, чем анализа высвобождения хрома для обнаружения опухоли антиген-специфических Т-клеток. Показаны% лизиса SKBR3 в ответ на различные концентрации p369-специфических Т-клеток, измеренная при 5 часов после опухоли и Т-клеток смешивании с использованием как сопротивление на основе анализа и анализа высвобождения хрома. Каждый символ представляет собой среднее (± SEM) из трех повторов. Результаты являются репрезентативными три отдельных экспериментов. Рисунок 5. % Внутри анализа коэффициенты вариации импеданса на основе анализа цитотоксичности Т-клетки. Показаны средние (± SD)% внутри анализа коэффициенты вариации в лизис SKBR3 в диапазоне концентраций антиген-специфических Т-клеток. Каждый символ представляет собой среднее из трех повторов. Цифры, приведенные в графе Tон имел в виду% резюме. вставки панели показывает среднее (± SEM, n = 3)% лизис SKBR3, при различных концентрациях p369-377-специфических Т-клеток. Два независимо генерируется p369-специфические Т клетки линий с использованием Т-клеток из двух отдельных доноров показаны.