Determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule T umane Her2neu CD8 confrontando il Cr51 saggio di rilascio al Sistema xCELLigence

1. Generazione di breve termine umano antigene-specifiche linee di cellule T CD8 7 Sangue celle separate mononucleate periferiche (PBMC) del sangue dei donatori di positivi HLA-A2 sani utilizzando Ficoll-Paque più. Aggiungere 2 ml / pozzetto di PBMC a 6 pozzetti a 2 x 10 6 cellule / ml. Aggiungere HLA-A2-binding HER-2/neu p369-377 peptide (sequenza amminoacidica KIFGSLAFL) o HLA-A2-binding influenzale P58-66 peptide (GILGFVFTL) direttamente ai pozzetti ad una concentrazione finale di 10 pg / ml e posto in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. Per contribuire a stimolare ed espandere le cellule T, aggiungere, ogni 2 giorni, 250 mezzi l / pozzetto freschi integrati con IL-2 ricombinante umana (magazzino: 50 unità / ml) per ottenere una concentrazione finale di 50 unità / ml nel terreno di coltura. Ri-stimolare le cellule di coltura con 2 x 10 6 cellule / ml PBMC autologhi irradiati pulsate per 2 ore con 10 pg / ml degli stessi peptidi utilizzanod nel passaggio 1.3 e aggiungere queste cellule per colture a 1 ml / pozzetto una settimana dopo la prima stimolazione con il peptide. Aggiungi IL-2 e fresco mezzi ricombinanti umani, come descritto al punto 1.4, nelle culture esistenti ogni 2 giorni. Ri-stimolare le cellule con peptidi e PBMC autologhi irradiati come descritto al punto 1.5 una settimana dopo la seconda stimolazione con il peptide. Preparatevi ad usare le cellule sei giorni dopo l'ultima ri-stimolazione al più presto. 2. Preparazione delle cellule tumorali del seno Posizionare la stazione di misura di impedenza xCELLigence (stazione xCELLigence) in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. Cellule tumorali umane raccolto (SKBR3, BT20, MCF7 o HCC1419) che sono il 75% confluenti usando tripsina 0,25% e centrifugazione (1000 rpm per 5 minuti). Contare le cellule tumorali con un emocitometro e li ricostituire in mezzi RPMI tumorali (supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 500 unità / mlIFN-gamma) ad una concentrazione di 7,5 x 10 3 tumorale cellule/100 microlitri. Programmare il software xCELLigence impostando il layout di pagina per determinare la configurazione bene e impostando la pagina di pianificazione per le letture dell'impedenza ogni 5 minuti per un periodo di 40 ore. Per le prime 18 ore, il sistema xCELLigence otterrà letture di impedenza dei solo le cellule tumorali. Aggiungere 100 ml di RPMI supporti tumore al xCELLigence E-piastre ed eseguire un sfondo leggendo misurando impedenza in assenza di cellule. Aggiungi cellule tumorali alla e-piastre a 100 l per pozzetto e posto nella stazione xCELLigence. Premere il pulsante di avvio del software xCELLigence per iniziare a prendere dei valori di impedenza delle cellule tumorali, che subito iniziano aderendo alla e-piastre. 3. Co-cultura del tumore con le cellule T CD8 Una volta che le cellule tumorali hanno attaccato e raddoppiato a 1,5 x 10 4 cellule tumorali per pozzetto (approssimativarca 18 ore dopo essere stato inizialmente placcato), le cellule T raccolto preparati in Sezione 1 per raschiatura dolce e agitazione Centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti e contare le cellule T utilizzando un emocitometro e li ricostituire in RPMI multimediale con 10% FBS a rapporti diversi, a partire da un rapporto massimo di 1 cellula tumorale di 40 cellule T e diluire 2 volte finché un rapporto di 1 cellula tumorale di 1,25 cellule T è raggiunto. Per esempio, ci sono 1,5 x 10 4 cellule tumorali per pozzetto. Per ottenere un rapporto 1:40, aggiungere 6 x 10 5 cellule T per pozzetto e diluire le cellule T 2 volte fino ad un rapporto di 1,5 x 10 4 cellule tumorali a 1.875 x 10 4 cellule T per pozzetto (rapporto 1:1,25) è raggiunto. Mettere in pausa la stazione xCELLigence e rimuovere la E-piastra. Rimuovere il supporto nei pozzetti con una pipetta e aggiungere 200 ml di solo supporto o il rapporto appropriato delle cellule T ai pozzetti. Posizionare la parte posteriore E-targa nella stazione xCELLigence e continuare il software pro xCELLigencegram così letture di impedenza vengono prese ogni 5 minuti per circa 20 ore dopo aggiunta cellule T. Normalizzare i risultati alla fine del saggio. 4. Chromium uscita Assay (CRA) 7 Seguire le procedure di sicurezza di radiazione istituzionali quando si lavora con 51 Cr e 51 cellule bersaglio Cr-etichettati. Usare sempre appropriata schermatura per ridurre l'esposizione alle radiazioni. Cellule tumorali impulsi per 2 ore a 1 x 10 6 cellule / ml tumorali con 10 microlitri / ml fresco 51 Cr (0.005 Ci / ml). Lavare le cellule tumorali in 10 ml di RPMI multimediale con 10% FBS e centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti. Aggiungere cellule tumorali a una piastra 96 pozzetti a fondo rotondo a 1 x 10 5 cellule tumorali in 100 pl / pozzetto. Aggiungere cellule T a vari rapporti, a partire da 1 cellula tumorale di 40 cellule T e diluire 2 volte finché un rapporto di 1 cellula tumorale di cellule T si ottiene 1.25. Per esempio, ci sono 1 x 10 5 cellule tumorali per pozzetto. Per ottenere un rapporto 1:40, aggiungere 4 x 10 6 cellule T per pozzetto e diluire le cellule T 2 volte fino ad un rapporto di 1 x 10 5 cellule tumorali a 1,25 x 10 5 cellule per pozzetto (T 1:1,25 ratio) è raggiunto. Aggiungere i controlli delle cellule tumorali spontanee e massima alla piastra. Per calcolare il rilascio spontaneo di 51 Cr dalle cellule tumorali, aggiungono sei pozzetti contenenti ciascuno 1 x 10 5 cellule tumorali in 100 pl a 100 pl di RPMI multimediale con 10% FBS. Per calcolare massimo rilascio di 51 Cr dalle cellule tumorali, aggiungere sei pozzetti contenenti ciascuno 1 x 10 5 cellule tumorali in 100 microlitri di 100 microlitri 0,1% Triton X-100 in PBS, che lisa tutte le cellule. Incubare le piastre per 5 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. Dopo l'incubazione, rimuovere 50 ml di surnatante da ogni pozzetto e aggiungerlo a una piastra di Luma. Essiccare le piastre per una notte e misurare CPM in un contatore gamma. Le "Lysis calcolo> 5. Percentuale Saggio di impedenza: Prendere la lettura di impedenza, segnalato come l'indice di cella (CI), in vari momenti e utilizzare la seguente formula per determinare la percentuale di lisi: (tumore CI solo – (tumore + cellule T CI)) / (CI solo tumore) * 100. CRA: Utilizzare la seguente formula per determinare la percentuale di lisi: (CPM sperimentale – CPM spontaneo) / (CPM massimo – CPM spontanea) * 100. 6. Rappresentante dei risultati Cellule T da solo non aumentano impedenza Cellule T, in generale, non aderiscono alle superfici più solide e non richiedono l'adesione per l'attivazione e la proliferazione. Pertanto, è stato ipotizzato che le cellule T non dovrebbero contribuire ad impedenza sul xCELLigence E-piastre. Per verificare ciò, i pozzi sono stati caricati sia con SKBR3 cellule di cancro al seno o di cellule T CD8 appena purificati umani. Impedenza è stata misurata nel corso di 40 ore e un esempio rappresentativo demonstValutazione essenzialmente scarso effetto delle cellule T è mostrato nella Figura 1A. Al contrario, si potrebbe sostenere che le cellule T possono diminuire dell'impedenza sfondo, anche se solo leggermente. Nonostante ciò, co-coltura ha rivelato che il processo di aggiunta di cellule T a 18 ore dopo l'avvio di misure di impedenza determinato un perturbazione impedenza (Figura 1B). Altri studi hanno rivelato che erano interruzioni dovuto in parte alla manipolazione poiché la diminuzione del segnale potrebbe essere ridotta tramite temperatura della soluzione di cellule T-contenente era lo stesso come l'interno dell'incubatrice. Riduzioni di impedenza mediata da cellule T sono dose-dipendenti. L'utilità di un test di impedenza a base di confrontare campioni per l'attività citotossica delle cellule T richiede la capacità di distinguere tra diverse concentrazioni di cellule T antigene-specifiche. Per verificare se questo è possibile, le cellule SKBR3 erano co-coltura con differenti concentrazionizioni di cellule T derivate da un HER-2/neu p369-specifica linea cellulare T. Come mostrato in Figura 2A, riduzioni impedenza erano dipendenti dalla dose di cellule T. Figura 2b mostra che gli indici di cellule a 10 ore seguono un semplice polinomio di secondo ordine nella gamma di cellule T. Così, la stazione xCELLigence monitora CD8 cellule T mediata morte di SKBR3 tumori in tempo reale come una goccia in indice cella. Il saggio impedenza basata rileva le cellule T antigene-specifiche Per determinare se la riduzione dell'impedenza di SKBR3, che è un cancro linea cellulare tumorale HER-2/neu e HLA-A2 positivi seno, da HER-2/neu p369 cellule T antigene-specifici erano specifici, pozzetti separati contenenti SKBR3 stati inoltre incubate con le cellule T derivate da una influenza (influenza)-specifica linea cellulare T. Le cellule T specifiche-INFLUENZA servito come controllo non specifico, essendo HLA-A2 positivi, ma non avendo alcuna capacità di riconoscere HER-2/neu. Come mostrato in Figura 3, vi è una differenza significativa tra l'attività litica delle cellule T HER-2/neu p369-specifici rispetto alle cellule T FLU-specifici (p <0,0001). In alcuni casi, le cellule T non specifici per tumori (ad es FLU-specifico o anti-CD3/anti-CD28 stimolata) hanno dimostrato un basso livello di attività litica (Figure 3A-B). Cellule T possono uccidere in uno dei due modi, o non specificamente attraverso Fas: ligando Fas o antigene-specificamente attraverso il rilascio di granzimi e perforine. Per corroborare ulteriormente l'idea che le cellule T HER-2/neu-specific stavano uccidendo in modo antigene-specifica, abbiamo incorporato un anticorpo bloccante di Fas ligando. Come mostrato in figura 3B, l'anticorpo non ha ridotto l'attività litica delle cellule T HER-2/neu p369-specifici. L'anticorpo potrebbe inibire le interazioni tra Fas e Fas Ligand, come dimostrato con le cellule T che sono stati attivati ​​in modo non specifico con anti-CD3/CD28 perline. Questi risultati suggeriscono che quandocellule T tumore-specifici sono testati con cellule T non-tumore-specifici, Fas ligando blocco può essere necessaria per ridurre la non-TCR interazioni mediate al minimo. In alternativa, quando si utilizza coltivate cellule T linee a breve termine in cui solo una frazione delle cellule T sono specifici per l'antigene utilizzato per la generazione ex vivo, la possibilità di attivazione delle cellule T mediata disadattamento MHC potrebbe verificarsi che porta a lisi non specifica. In questo caso, l'aggiunta di anticorpi che bloccano i HLA irrilevanti può essere giustificato. Per determinare se le cellule T p369-specifiche sono state uccidendo le cellule tumorali in un HLA di classe I modo dipendente, sia anticorpi anti-HLA di classe I o di anticorpi isotipo di controllo sono stati aggiunti al co-culture. Come mostrato in Figura 3C, lisi da cellule T specifiche p369-fu soppresso dalla inclusione di anticorpo dimostrare HLA classe I restrizione. Infine, dato che lo sviluppo di questo saggio è stata largamente fatto usando SKBR3, era importante accertare se altri aderente HLA-Cellule tumorali che esprimono A2 e HER-2/neu potevano essere uccisi da cellule T p369-specifiche. Così, le cellule T sono stati preparati e aggiunti in un rapporto 1:5 a HLA-A2 e cellule tumorali HER-2/neu-expressing, SKBR3, MCF-7, e HCC1419 cellule. La linea tumorale negativo HLA-A2, BT20 è stato utilizzato come controllo negativo. Come mostrato in figura 3D, tutte queste cellule tumorali aggiuntivi, tranne BT20 sono stati uccisi come valutato dal impedenza. Così, il metodo sembra essere utile per molteplici cellule tumorali bersaglio aderenti. Il saggio impedenza-based è più sensibile del saggio di rilascio di cromo standard nella rilevazione dell'attività delle cellule T citotossica La (51 Cr) saggio di rilascio di cromo (CRA), che misura l'attività citolitica è stato a lungo il gold standard con cui monitorare le risposte delle cellule T CD8. In questo saggio, le cellule bersaglio (ad esempio cellule tumorali) sono etichettati con 51 Cr. Nella maggior parte dei casi, le cellule bersaglio sane possono conservare la maggioranza delradiotracciante nel corso del test. Cellule T CD8 vengono aggiunti alle cellule bersaglio, di solito a concentrazioni variabili, e l'uccisione delle cellule bersaglio viene rilevato dal rilascio di 51 Cr nel mezzo. A parte il fatto che utilizza radiazioni pericolose, due problemi principali con il CRA sono una mancanza di sensibilità e che il saggio richiede normalmente grandi quantità di cellule T CD8, limitando la sua utilità. Per determinare se il saggio impedenza era basata più sensibili di cellule T specifiche CRA-p369, HER-2/neu sono stati generati in vitro e applicata, in quantità variabili, sia per E-piastre contenenti cellule tumorali senza etichetta o piastre di polipropilene standard contenenti 51 Cr-etichettati cellule bersaglio. Misure, sia cromo impedenza o libero, sono state misurate a 5 ore dopo aggiunta cellule T. Figura 4, un esempio rappresentativo, mostra l'analisi di impedenza supera il rilascio di cromo. La variazione intra-saggiodel dosaggio impedenza-based è tipicamente inferiore al 20%. Variazione intra-saggio è stata esaminata, poiché ampio utilizzo di questo saggio sarà in gran parte determinato dalla sua riproducibile e variazione (Figura 5). Due linee di cellule T specifiche p369-state generate indipendentemente 30 giorni a parte e aggiunte in triplicato su una gamma di cellule tumorali a rapporti di cellule T. L'inserto grafico in Figura 5 mostra che le linee sono state in gran parte equivalenti in termini di lisi SKBR3 cellule. Il coefficiente di variazione% è stato calcolato ad ogni rapporto cellulare e tracciati. Come mostrato in figura 5, tra 01:40 e 01:05 coefficienti coefficienti% di variazione (CV) erano inferiori al 15%. Al 1:2,5 e 1:1,25, tuttavia, i CV erano alte o imprevedibile. Causa della ampia variabilità biologica, non è possibile misurare la variabilità inter-saggio con linee cellulari primarie T. <br /> Figura 1. Impedenza deve essere normalizzato dopo l'aggiunta delle cellule T. Pannello A: dimostra che le cellule tumorali (linea rossa) e non le cellule T (linea blu) sono responsabili per l'impedenza. Sono mostrati i tracciati di impedenza più di 40 ore per le sole cellule tumorali sia o T. Risultati simili sono stati ottenuti da un secondo esperimento. Si noti che la perturbazione segnale a circa 20 ore rappresenta il punto di aggiunta di cellule T verso le pozzetti non contenenti cellule tumorali Pannello B:. Mostra che le misurazioni di impedenza sono transitoriamente interrotti con l'aggiunta di cellule T alle cellule tumorali. Questo richiede normalizzazione ad un certo punto di tempo dopo l'aggiunta di cellule T (Cfr. punto di normalizzazione marcato in grafico). Le tracce sono composte da punti di dati duplicati. La traccia per le sole cellule tumorali è mostrato in rosso. Le altre tracce rappresentano cellule tumorali co-coltura con cellule T HER-2/neu p369-specifiche (Blu: rapporto di 1,25 cellule T / cellule tumorali, Verde:rapporto di 40 cellule T cellule / tumorali). Ciascuna traccia è calcolata da punti di dati duplicati raccolti ogni 5 minuti attraverso la durata della cultura. I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti separati. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 2. Riduzione del mediata dalle cellule T impedenza è dose dipendente. Pannello A: indicato sono le tracce di impedenza dei SKBR3 cellule tumorali incubate solo o con diverse concentrazioni di cellule T tumore-specifici. Ciascuna traccia è calcolata da punti di dati raccolti in triplicato ogni 5 minuti attraverso la durata della cultura. I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti separati Pannello B:. Indicati sono gli indici delle celle di 10 ore in tutti cellule / tumore concentrazioni di cellule T. La linea tratteggiata rappresenta l'indice cella per le cellule tumorali aLuno. Ogni simbolo è la media (± SEM) delle determinazioni in triplicato. I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti separati. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 3. Il saggio basato impedenza rileva antigene-specifiche risposte delle cellule T citotossiche. Pannello A mostra il livello di lisi delle cellule SKBR3 da HER-2/neu cellule T p369-specifici (rosso) o cellule FLU-T specifiche (Blu) a 5, 10, e 15 ore dopo la co-coltura. Ciascun punto di dati rappresenta la media (± SEM) di misurazioni in triplicato. Risultati sono rappresentativi di tre esperimenti separati. Pannello B mostra lisi delle SKBR3 da cellule T p369-specifiche o cellule T attivate in modo non specifico, dimostrando che la lisi antigene-specifica non è causa di interazioni ligando Fas-Fas. Barre nere rappresentano co-colture checonteneva un anticorpo Fas ligando. Ogni barra rappresenta la media (± SEM) lisi in triplice copia a 5 ore dopo l'aggiunta di cellule T. I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti separati. Pannello C mostra lisi 10 ore dopo T aggiunta delle cellule di SKBR3 dalle cellule T p369-specifiche è HLA-classe I dipendente. In entrambi HLA-classe I blocking o controllo isotipico è stato aggiunto durante la co-coltura. Ogni barra rappresenta la media (± SEM) lisi in triplice copia. Questo esperimento è stato ripetuto due volte con risultati simili. Pannello D mostra% di lisi 10 ore dopo aggiunta delle cellule T di diversi HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing linee tumorali da cellule T p369-specifici. BT20, una linea cellulare di carcinoma mammario HLA-A2-negativo è stato utilizzato come controllo negativo. Ogni punto rappresenta un esperimento unico calcolato determinazioni in triplicato. Clicca qui per ingrandire la figura . <img src = "/ files/ftp_upload/3683/3683fig4.jpg" alt = "Figura 4" /> Figura 4. Il saggio basato impedenza è più sensibile del saggio di rilascio di cromo per la rilevazione di cellule T antigene-specifiche tumorali. Visualizzati sono% di lisi SKBR3 in risposta a concentrazioni variabili di cellule T p369-specifici come misurato con 5 ore dopo tumorali e cellule T miscelazione utilizzando sia il saggio di impedenza-based e il saggio di rilascio di cromo. Ogni simbolo è la media (± SEM) delle tre repliche. I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti separati. Figura 5. % Intra-saggio coefficienti di variazione del test di citotossicità delle cellule T impedenza-based. Presenti sono medie (± SD)% intra-saggio coefficienti di variazione in lisi di SKBR3 in un range di concentrazioni di cellule T antigene-specifiche. Ogni simbolo è la media di tre repliche. Numeri riportati nel grafico sono tintendeva dire% CV. pannello inserto mostra la media (± SEM, n = 3)% lisi di SKBR3, a concentrazioni variabili di cellule T p369-377-specifici. Sono mostrate due linee di cellule generate indipendentemente p369-T specifiche utilizzando cellule T da due donatori separati.