تحديد نشاط السامة للخلايا الأمثل للHer2neu CD8 خلايا تي محددة الإنسان من خلال مقارنة الفحص الإصدار Cr51 إلى نظام xCELLigence
Summary
الإفراج مقايسة الكروم، فحص مشتركة للكشف عن نشاط الخلايا السامة للخلايا T، لديها العديد من القيود. باستخدام خلايا CD8 T محددة مستضد والخط ورم سرطان الثدي البشرية، SKBR3، في هذه المادة، تم فحص نهج قائم على مقاومة لقدرة الكشف عن خلية القتل.
Abstract
السامة للخلايا CD8 خلايا تي تشكل مجموعة فرعية من الخلايا T التي هي قادرة على إحداث وفاة المصاب أو خبيث الخلايا المضيفة 1. هذه الخلايا التعبير عن مستقبلات متخصصة، تسمى مستقبلات الخلايا التائية (TCR)، والتي يمكن التعرف على الببتيد مستضدي محددة ملزمة لفئة HLA الأول الجزيئات 2. إشراك الخلايا المصابة أو الخلايا السرطانية من خلال بهم HLA الصف الأول نتائج جزيء في إنتاج جزيئات التحللي مثل granzymes وperforin مما أدى إلى موت الخلايا المستهدفة. في حين أنه من المفيد لتحديد ترددات محددة مستضد الخلايا CD8 T باستخدام فحوصات مثل ELISPOT أو التدفق الخلوي، بل هو أيضا مفيدة للتأكد من قوة CD8 استجابات الخلايا التائية باستخدام المقايسات السمسة 3. الفحص الأكثر تميزا لتقييم وظيفة السامة للخلايا هو الفحص الإصدار الكروم (CRA)، الذي يعتبر الفحص القياسية 4. وCRA لديها العديد من القيود، بما في ذلك التعرض للخلايا للأشعة غاما، LACK من التكاثر، وشرطا لأعداد كبيرة من الخلايا. على مدى العقد الماضي، كان هناك اهتمام في تبني استراتيجيات جديدة للتغلب على هذه القيود. أحدث المناهج وتشمل تلك التي تقيس كاسباس الإصدار 4، BLT النشاط استريز 5 والتعبير سطح CD107 6. تم فحص مقايسة على أساس مقاومة، وذلك باستخدام نظام xCelligence روش، في هذه الورقة لقدرته كبديل لCRA. مقاومة أو معارضة لتيار كهربائي يحدث عندما ربط الخلايا السرطانية تمسكا وحات القطب. فصل الخلايا السرطانية بعد القتل ويتم تخفيض مقاومة الكهربائية التي يمكن قياسها من قبل نظام xCelligence. القدرة على التكيف مع النهج القائم على مقاومة لتقييم قتل الخلية بوساطة يرتكز على الملاحظة أن خلايا T لا تلتزم بإحكام على معظم الأسطح و لا يبدو أن يكون لها تأثير كبير على مقاومة مما يقلل أي قلق من التدخل المباشر للخلايا T معالقياس. تظهر النتائج أن الفحص القائم على مقاومة يمكن الكشف عن التغييرات في مستويات السامة للخلايا CD8 خلايا تي مستضد معين مع زيادة الحساسية بالنسبة إلى CRA القياسية. وبناء على هذه النتائج، قد يكون النهج القائم على مقاومة بدائل جيدة لكالات التصنيف الائتماني أو الطرق الأخرى التي تهدف إلى قياس السامة للخلايا CD8 وظيفة الخلايا التائية.
Protocol
Discussion
CD8 خلايا تي هي مهمة للاستجابة المناعية التكيفية، أن تكون قادرة على قتل الخلايا المصابة مباشرة أو خبيثة 4. في حين أن هناك عدة طرق لقياس أعداد CD8 خلايا تي مستضد محددة (على سبيل المثال ELISPOT، tetramer، التدفق الخلوي)، غالبا ما يكون من المفيد أن نعرف ما إذا كانت هذه الخلايا هي السامة للخلايا وظيفيا 3. الفحص الأكثر تميزا لتقييم وظيفة السامة للخلايا هو CRA، التي تعتبر المعيار الذهبي فحص 4. القيود الرئيسية للCRA هي (1) شرط من النشاط الإشعاعي، (2) عدم وجود حساسية، (3) عدم وجود معلومات الآلي، (4) الحاجة إلى كميات كبيرة من خلايا، و (5) مجموعة شاقة تصل. وهكذا، على مدى العقد الماضي، كان هناك اهتمام في تبني استراتيجيات جديدة للحد من هذه القيود. أحدث المناهج وتشمل تلك التي تقيس كاسباس الإصدار 4، BLT استريز activity5، والتعبير سطح CD107 6. يوحي هذا المخطوط أنمقايسة على أساس مقاومة، التي تجرى على نظام xCelligence روش، قد يكون من المفيد كبديل لCRA أيضا. القدرة على التكيف مع النهج القائم على مقاومة تقوم على ملاحظة أن الخلايا التائية، التي لا تلتزم بإحكام على السطوح، لا يبدو أن يكون لها تأثير كبير على مقاومة مما يقلل أي قلق من التدخل المباشر للخلايا T مع القياس. ومن المتوقع أن تكون أقل بكثير في المقام الأول بسبب القضاء على المخاوف التنظيمية لاستخدام النشاط الإشعاعي العمالة اللازمة لاستخدام نظام الفحص مقاومة. والعيب الوحيد الملحوظ من النظام القائم على مقاومة هو أن انفاق 50000 $ إلى 60،000 دولار مطلوب للشراء وحدة xCelligence. ومع ذلك، فإن وحدة xCelligence يلغي الحاجة لمكافحة الإشعاع وأكثر تنوعا، كونها مفيدة لتقييم استجابة الخلايا الى المخدرات والهجرة بالإضافة إلى T السمية لخلايا 8.
الملاحظات التيهذا التقليص في مقاومة الخلايا السرطانية هي تعتمد على الجرعة، كما هو مبين في الشكل 2، مع منحدر حاد معقول بعد وظيفة بسيطة من الدرجة الثانية الثانوية تشير إلى أن مقايسة يمكن استخدامها في الحد من المقايسات تخفيف (LDAs) لتقدير تردد من الخلايا السامة للخلايا 9 . ميزة واحدة مع النهج القائم على مقاومة هو أن عدد الخلايا T والخلايا السرطانية المطلوب هو أقل من CRA، مما يجعل LDA يحتمل أكثر جدوى. على سبيل المثال، في CRA، في نسبة 1:40، 1 × 10 5 الخلايا السرطانية لكل بئر ومطلي الذي يتطلب 4 × 10 6 خلايا T المشاركات لكل بئر. ومع ذلك، في مقايسة على أساس مقاومة، وهناك حاجة فقط 1.5 × 10 4 الخلايا السرطانية لكل بئر، والذي يستهلك فقط 6 × 10 5 مجموع الخلايا التائية لكل بئر. وهكذا، يستخدم الفحص القائم على مقاومة الخلايا T 85٪ أقل والخلايا السرطانية. يشير هذا الانخفاض إلى أن النظام القائم على مقاومة يمكن تكييفها لرصد المناعية في تجارب اكلينيكية على البشر حيث tكان حجم الدم تلفت قد تكون محدودة. أيضا، بينما هو CRA يقتصر على نقطة مرة واحدة، ومقايسة على أساس مقاومة بجمع البيانات في الوقت الحقيقي المستمر، مما يتيح للمستخدم لمقارنة عدة نقاط وقت تحلل على نفس التجربة مع الحد الأدنى من العمل وخلايا إضافية. يحتمل أن تكون مجتمعة الحسابات تردد مع الاستراتيجيات الأخرى التي لا قياس وظيفة مثل التحليلات tetramer لإقامة نسبة الخلايا التائية السامة للخلايا وظيفية إلى مجموع مستضد محددة CD8 خلايا T 10. واحدة من السمات الأكثر جاذبية من النهج القائم على مقاومة هو أنه، وخلافا لمعظم فحوصات أخرى، السمسة يمكن رصدها في الوقت الحقيقي، ويحتمل أن تكون مما يجعل من الاسهل لدراسة التفاعلات الخلوية مع استخدام مثبطات أو الأجسام المضادة. آخر هو أن الطريقة قد تكون مناسبة لالخلايا السرطانية التي تقاوم وضع العلامات. وأخيرا، منذ الخلايا السرطانية غير قتل لا وصفت وتبقى عقيمة، مزيد من الحصاد ودراسة الخلايا مقاومة للخلية T هو وقت possibجنيه.
في ملخص، في حين توفر كلا النظامين قتل البيانات ورم في استجابة لخلايا T معينة، الفحص القائم على مقاومة هو أكثر حساسية من CRA وتوفر منصة أكثر مرونة.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة إلى كيث L. كنوتسون من سوزان جي كومن من أجل العلاج ومؤسسة المعاهد الوطنية للصحة / NCI 9R01 CA152045 P50-CA116201 و.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Used to isolate PBMCs from blood |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | Cell culture media |
| FBS | Denville Scientific | FB5001-H | Cell culture media |
| Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-81 | For stimulating growth of T cells |
| Human Interferon gamma | Cell Sciences | CR2026 | For stimulating MHC expression in tumor cells |
| HER-2/neu p369-377 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence KIFGSLAFL | Binds to HLA-A2 |
| Influenza p58-66 peptide | Mayo Clinic peptide synthesis core | amino acid sequence GILGFVFTL | Binds to HLA-A2 |
| Human CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen | 111-61D | For non-specific T cell activation and expansion |
| Chromium-51 | MP Biomedicals | 62015 | CRA labeling reagent |
| E-plate | Roche Applied Science | 05469830001 | For xCelligence impedance unit |
| Luma plate 96 | Perkin Elmer | 6005630 | For measuring radioactivity in the Top Count NXT. |
| xCelligence RTCA DP Station | Roche Applied Science | RTCA DP | Impedance unit |
| Top Count NXT | Perkin Elmer | C990601 | Scintillation & Luminescence Counter |
| Fas Ligand antibody | BD Biosciences | 556372 | For blocking Fas-Fas ligand interactions |
| HLA-A2 BB7.2 antibody | BD Biosciences | 551230 | For blocking HLA class I |
| Mouse IgG2b, κ | BD Biosciences | 555740 | Isotype control for HLA class I |
| SKBR3 tumor line | ATCC | HTB-30 | Adenocarcinoma |
| MCF7 tumor line | ATCC | HTB-22 | Adenocarcinoma |
| HCC1419 tumor line | ATCC | CRL-2326 | Primary ductal carcinoma |
| BT20 tumor line | ATCC | HTB-19 | Carcinoma |
Riferimenti
- Zhang, N., Bevan, M. J. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system. Immunity. 35, 161-168 (2011).
- Garboczi, D. N. Structure of the complex between human T-cell receptor, viral peptide and HLA-A2. Nature. 384, 134-141 (1996).
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Andersen, M. H., Schrama, D., Thor Straten, P., Becker, J. C. . Cytotoxic T cells. J. Invest. Dermatol. 126, 32-41 (2006).
- Weren, A., Bonnekoh, B., Schraven, B., Gollnick, H., Ambach, A. A novel flow cytometric assay focusing on perforin release mechanisms of cytotoxic T lymphocytes. J. Immunol. Methods. 289, 17-26 (2004).
- Aktas, E., Kucuksezer, U. C., Bilgic, S., Erten, G., Deniz, G. Relationship between CD107a expression and cytotoxic activity. Cell Immunol. 254, 149-154 (2009).
- Knutson, K. L., Schiffman, K., Disis, M. L. Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER- 2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients. J. Clin. Invest. 107, 477-484 (2001).
- Asiedu, M. K., Ingle, J. N., Behrens, M. D., Radisky, D. C., Knutson, K. L. TGFbeta/TNF(alpha)-mediated epithelial-mesenchymal transition generates breast cancer stem cells with a claudin-low phenotype. Cancer Res. 71, 4707-4719 (2011).
- Strijbosch, L. W., Buurman, W. A., Does, R. J., Zinken, P. H., Groenewegen, G. Limiting dilution assays. Experimental design and statistical analysis. J. Immunol. Methods. 97, 133-140 (1987).
- Gallimore, A. Induction and exhaustion of lymphocytic choriomeningitis virus-specific cytotoxic T lymphocytes visualized using soluble tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complexes. J. Exp. Med. 187, 1383-1393 (1998).
