创建瞬态细胞膜毛孔，使用标准的喷墨打印机

1。转换的HP DeskJet 500 应当指出，这种技术应与许多商用喷墨打印机。然而，旧的打印机往往更好的工作，因为他们使用的墨盒，直径较大的喷嘴，不堵塞一样容易。此外，旧的打印机往往使用机械的进纸传感器，很容易绕过。打印机与光学传感器可以被欺骗，但使用打印机在每个周期远缘的小片纸，但比机械系统的​​“猫腻”多一点困难。目前市面上的打印机工作最好有低的分辨率（DPI）。 更高分辨率的打印机往往更容易堵塞。惠普Deskjet 500的分辨率为300 dpi。有许多市售的打印机（HP Deskjet系列及其他），有一个600 dpi的分辨率。这种类型的打印机可以使用只是一个小喷嘴增加堵塞可缓解（第3）仔细清洗的问题。 解锁从底座打印机的几个塑料夹，慢慢抬起顶部关闭删除打印机顶部的塑料外壳。 松开按钮/显示打印机顶部的光面板，离开它连接到打印机的主板。 清洁打印机内部，尤其是地区的地方在于墨盒和印刷发生。 找到电缆供电纸机制，并从主板上拔下。 在HP DeskJet 500，这些被发现略低于朝着左前方的纸盒。 找到纸张检测机制。绕过字符串或线环作为手动拉手追究机制。 纸检测机制中的HP DeskJet 500，上方和后方的印刷/纸机制发现一个灰色的塑料杆。 创建一个阶段，在进纸机制，以便将美联储从纸张和沉积前把所需的打印墨盒打印头正下方水平的幻灯片。 对于我们的实验中，泡沫航运持有15 mL离心管，用几个显微镜在印刷区域的地方录音，幻灯片，使幻灯片的最后一级所需的高度。 要保持无菌技术，打印机可以被放置在一个标准的生物危害柜或桌面层流罩。 重要的是要注意，修改市售喷墨打印机通常会打印机制造商的保修失效。 2。转换为股票的惠普墨盒（HP 26黑色墨盒） 从包装中取出墨盒，留下暂时覆盖打印机的接触和打印头的保护胶带。 稳住身体用夹具或台钳（只需牢牢抓住通常工作以及手工墨盒），留下任何障碍绿色明确墨盒（黑色部分）。 用钳子或活动扳手，把握绿色墨盒的顶部和扭动，来回几次，直到它打破了自由。 这是不应该花太多的力量，但不再需要的顶端，所以它是好的，如果它打破取出时。 用螺丝刀撬开现在暴露的透明塑料片。 再次，这不应该花太多的力量，但它不会需要，因此它是好的，如果它在搬迁过程中打破。 清空任何其余水库。 取下塑料覆盖打印机的接触和打印头的保护胶带。 水库的水彻底冲洗。 使用吸管或注射器推水通过渠道。 水从打印头中可能会泄漏这个过程中，这是可以接受的，并不会造成任何破坏墨盒的功能。 当水运行明确，使墨盒晾干。 3。清洁墨盒为了保持一个干净的印刷环境，使用前后应清洗墨盒。 这也有助于避免结晶盐和其他生物材料的墨盒可能会导致堵塞。 完全淹没在去离子水的烧杯墨盒，超声15分钟之前和之后，印刷。 超声波处理后，取出墨盒从水中，摇出多余的水分。 70％的乙醇喷入墨盒，以创造更多的无菌环境。 确保乙醇加入bioink印刷解决方案之前，干燥。 4。细胞悬液 – “生物墨“ 培养细胞，直到准备到通过。 3T3成纤维细胞：约1.3×10 4细胞/厘米2 Dulbeccos改性老鹰培养基（DMEM培养基），10％胎牛血清（FBS），对T-75瓶种子细胞。两天孵化器培养细胞在37°C间和5％的CO 2。 使G-肌动蛋白的荧光浓度原液在磷酸盐缓冲液（PBS）的50微克/毫升。 传代细胞。 3T3成纤维细胞：从烧瓶中取出的媒体，用PBS冲洗两次。覆盖细胞用5毫升0.25％胰蛋白酶+ EDTA和孵育5分钟。 新鲜培养基中加入5毫升到15毫升锥形离心管中，并在5分钟1000转离心吸取细胞悬液。抽吸介质花。 荧光G-肌动蛋白原液创建bioink PBS重悬细胞。 bioink应该有一个G-肌动蛋白的终浓度10微克/毫升和细胞合作ncentration的1×10 5细胞/毫升。这个浓度已经得到了优化，以限制每一滴水和打印头堵塞的细胞数量。 请注意，250μl的bioink的打印模式如图2所示的三个盖玻片。 5。 Bioprinting 电源和让打印机热身。 地方所需的印刷面（在这里，我们使用22毫米×22毫米盖玻片）在步骤1.6准备阶段的中心。 创建一个印刷图案文件。 打开Microsoft Word（或任何其他的绘图软件），并绘制所需的图案。 挑选一个细胞中的预制文件印刷所需的打印模式。 加载所需的细胞悬液的制备墨盒。 移液器悬挂墨盒舱底部的小圆形。使用约100-120微升的溶液。打印的墨滴大小，大约是130皮升8。 惠普Deskjet 500打印机打印文件。 为了达到最佳效果，打印小图案（5）多次，通过改变在文字处理程序所需的副本数量。 打印机将再次热身，然后墨盒会移动到“准备位置”。 当墨盒移动到准备位置（稍远低于左侧的墨水滴，并在那里停留），拉进纸机制电线，并应开始打印。 对于多个副本的印刷，纸机制将每个周期或页打印后公布。墨盒，然后将返回到“准备就绪”的位置，进纸机制电线应该再次被提出。 打印机将打印到盖玻片上的印刷阶段的中心放置在步骤5.2（ 见图2）。 6。代表结果</ P> 整个转换过程中的一个标准的，现成的惠普Deskjet 500的有代表性的成果，标准HP 26系列墨盒，将创建一个打印机与如前所述印刷多种类型的细胞分析解决方案的能力。转换完成后的打印机， 如图3所示，放置在显微镜的盖玻片上印刷阶段。打印机可以在许多领域的分析是有用的，包括但不限于：单细胞力学，组织工程，基因转染，缩微传感器，和直接的细胞疗法1-10，16-22。 在这个例子中的HP Deskjet 500打印机和惠普26系列墨盒被为bioprinting修改。使用该打印机设置了一个G-肌动蛋白单体溶液中的成纤维细胞悬液组成bioink，细胞被印到玻璃显微镜的盖玻片。 图1说明了代表水库印刷的成纤维细胞的ULTS，这表明成立荧光的肌动蛋白单体。结果在控制的无菌环境中的细胞被印制成定制模式。 在这个例子中使用的模式是建立在Microsoft Word中（ 图2）。这种模式建立了一个横跨大多数的显微镜幻灯片的打印解决方案的不断线。 图4显示了直线的bioink和细胞相互存放。应当指出后，立即打印，有一个背景荧光的增加，细胞被暂停，因为bioink解决方案，包含免费过量荧光的肌动蛋白单体。此背景荧光显着减小后增加细胞（ 图1），洗去多余的基板单体的生长介质。 ad/3681/3681fig1.jpg“/> 图1。3T3成纤维细胞3小时后，使用修改后的喷墨打印机打印的代表图像。细胞内部，显示纳入荧光标记的肌动蛋白单体。标尺代表50微米。 图2。设计用于打印bioink的。 图3。与泡沫塑料阶段转换后的打印机。在中间的橙色线绕过纸杆传感器。 图4。代表的形象印在本地化印刷区3T3成纤维细胞。 5分钟后打印在20倍放大倍率的显微镜图像。 / files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg“/> 图5。3小时后，呈现出成纤维细胞具有内在荧光的肌动蛋白单体的印刷所采取的荧光图像（40倍放大倍率）。比例尺代表50微米。 图6。印刷15分钟后，采取了细胞的荧光显微镜（20倍放大倍率）。图像显示两个G-肌动蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。从左至右依次为：G-肌动蛋白的Alexa Fluor 488，细胞核用DAPI，两者的叠加。 图7显示在印刷后3小时的在线模式两成纤维细胞的荧光显微镜。左边的图像显示荧光标记的细胞内的肌动蛋白单体。右边的图片是一个荧光通道与背景图像的叠加显示，虽然幻灯片（左下角），可能会有一些碎片，它不会发出荧光。标尺代表50微米大小，如果不表示最右边是3个小时的培养与荧光标记单体的非印刷细胞的对照组。此控件是为了表明，单体无法穿透无膜通透性细胞膜细胞印刷。