Crear transitoria poros de la membrana de células utilizando una impresora de inyección de tinta estándar

1. La conversión de la HP Deskjet 500 Cabe señalar que esta técnica debe trabajar con muchas impresoras de inyección de tinta comercialmente. Sin embargo, las impresoras más antiguas tienden a funcionar mejor ya que utilizan cartuchos de tinta con boquillas de mayor diámetro, los cuales no obstruir con la misma facilidad. Además, las impresoras más antiguas tienden a utilizar sensores mecánicos de alimentación de papel que son más fáciles de sortear. Las impresoras con sensores ópticos pueden ser engañados, pero con una pequeña tira de papel en el extremo más alejado de la impresora en cada ciclo, pero es un poco más difícil que el sistema mecánico de "engañar". Las impresoras actualmente disponibles en el mercado que mejor funcionan tienen una resolución baja (DPI). Más altos de resolución de las impresoras tienden a obstruir con mayor facilidad. La resolución de la impresora HP Deskjet 500 es de 300 DPI. Hay muchas impresoras disponibles en el mercado (HP Deskjet serie y otros) que tienen una resolución de 600 DPI. Este tipo de impresora se puede utilizar con sólo un pequeño aumento en la boquillaobstrucción de las cuestiones que pueden aliviarse con una limpieza cuidadosa (sección 3). Quite la cubierta superior de plástico de la impresora mediante el desbloqueo de algunos clips de plástico de la base inferior de la impresora y levantando lentamente la parte superior fuera. Desenrosque el botón / luz de la pantalla del panel de la parte superior de la impresora, dejándolo conectado a la placa base de la impresora. Limpiar el interior de la impresora, especialmente las áreas donde se asienta el cartucho de tinta y donde se produce la impresión. Ubique los cables que suministran energía a los mecanismos de alimentación de papel y desconectar de la placa base. En el HP DeskJet 500, éstos se encuentran justo debajo de la bandeja de papel hacia la izquierda de la parte delantera. Busque mecanismo de detección de papel. Omitir el mecanismo de fijación por una cuerda o lazo de alambre para servir como un mango de tracción manual. En el HP DeskJet 500, el mecanismo de detección de papel es una palanca de plástico gris encuentra por encima y detrás del mecanismo de alimentación de impresión / papel. Crear un escenario delante del mecanismo de alimentación de papel (donde el papel se alimenta desde y depositados) con el fin de llevar las diapositivas de impresión deseados a un nivel justo por debajo del cabezal de impresión del cartucho. Para nuestros experimentos, el titular de embalaje de espuma para los tubos de 15 ml de centrífuga se utiliza con varios portaobjetos en el lugar correspondiente en la región de impresión para que el nivel final de las diapositivas a la altura deseada. Para mantener la técnica aséptica, la impresora puede ser colocada dentro de un gabinete estándar de riesgo biológico o una campana de flujo laminar de mesa. Es importante señalar que la modificación de un comercialmente disponible de chorro de tinta por lo general se anulará la garantía de la impresora fabricante. 2. Conversión de las imágenes de archivo cartuchos de tinta HP (HP 26 cartucho de tinta Negro) Retire el cartucho de su embalaje, dejando la cinta protectora que cubre los contactos de la impresora y el cabezal de impresión, por el momento. Estabilizar el cuerpodel cartucho (parte de color negro) o bien con una pinza o tornillo de banco (simplemente toma firmemente el cartucho de la mano por lo general funcionado tan bien), dejando el verde claro encima de cualquier obstáculo. Con unos alicates o una llave ajustable, tome la parte superior verde bajo el cartucho y gire hacia atrás y adelante varias veces hasta que se libera. Esto no debería tener mucha fuerza, pero la parte superior ya no es necesaria, por lo que está bien si se rompe al sacarlo. Uso de destornilladores, saque la pieza de plástico transparente ahora expuestos. Una vez más, esto no debería tener mucha fuerza, pero no será necesaria, por lo que está bien si se rompe durante la extracción. Vacíe cualquier resto del depósito. Retire la cinta protectora de plástico que cubre los contactos de la impresora y la cabeza de impresión. Lavar los depósitos con agua. Utilice una pipeta o una jeringa para empujar el agua a través de los canales. El agua es probable que escape de la cabeza de impresión duranteeste proceso, lo que es aceptable, y no causa ningún daño a la funcionalidad del cartucho. Cuando el agua salga clara, permita que el cartucho se seque. 3. Limpieza de cartuchos de tinta A fin de mantener un ambiente de impresión limpio, el cartucho de tinta debe ser limpiado antes y después del uso. Esto también ayuda a evitar la cristalización de las sales y otros materiales biológicos en el cartucho que podrían causar obstrucciones. Totalmente sumergir el cartucho en un vaso lleno de agua desionizada, y sonicar durante 15 minutos antes y después de la impresión. Después de ultrasonidos, retire el cartucho del agua, y sacuda el exceso de agua. Aerosol etanol 70% en el cartucho para crear un ambiente más aséptico. Asegúrese de que el etanol se ha secado antes de añadir la solución de impresión bioink. 4. Hacer que la suspensión de la célula – "Biotinta " Las células de cultivo hasta el momento de pasaje. Para los fibroblastos 3T3: las células de semillas en matraces T-75 a unos 1.3×10 4 células / cm 2 en Dulbeccos Eagles medio modificado (DMEM) con suero fetal bovino al 10% (FBS). Las células de cultivo para dos días en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. Hacer fluorescente g-actina solución madre a una concentración de 50 ug / ml en solución tampón de fosfato (PBS). Las células de paso. Para los fibroblastos 3T3: Quite el papel del matraz y enjuagar dos veces con PBS. Cubrir las células con 5 ml de 0,25% de tripsina + EDTA y se incuba durante 5 minutos. Añadir 5 ml de medio fresco y pipetear la suspensión de células en un tubo de 15 ml de centrífuga cónico y centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Aspirar pasado medio. Resuspender las células en PBS con una solución fluorescente de acciones del G-actina para crear bioink. Bioink debe tener una concentración final de g-actina de 10 ug / ml y un co célulancentration de 1×10 5 células / ml. Esta concentración se ha optimizado para limitar la cantidad de células por gota y la obstrucción de la cabeza impresora. 8 Nótese que 250 l de bioink imprime tres cubreobjetos con el modelo mostrado en la Figura 2. 5. Bioprinting Encienda la impresora y deje que se caliente. Lugar deseado superficie de impresión (aquí, se utiliza 22 mm x 22 mm cubreobjetos) en el centro de la etapa preparada en la etapa 1.6. Crear un archivo de patrones de impresión. Abra Microsoft Word (o cualquier otro software de dibujo), y dibujar el patrón deseado. Elija un patrón de impresión deseada para la impresión de células en el archivo preparado de antemano. Cargar el cartucho preparado con suspensión celular deseada. Pipeta suspensión en la circular pequeñas bien en la parte inferior del compartimento de cartucho. Utilice aproximadamente 100-120 l de solución. El tamaño de la gota impreso es de alrededor de 1308 picolitros. Imprimir el archivo con la impresora HP Deskjet 500. Para obtener los mejores resultados, imprima los patrones más pequeños varias veces (5), cambiando la cantidad de copias que desea en el programa de procesamiento de textos. La impresora se caliente de nuevo, a continuación, el cartucho se moverá a la "posición de arranque". Cuando el cartucho se mueve hacia la posición de preparado (un poco a la izquierda de que el goteo de tinta muy por debajo y se queda allí), tire hacia arriba del alambre de mecanismo de alimentación de papel y la impresión comenzará debe. Para obtener copias múltiples de la impresión, el mecanismo de alimentación de papel tendrá que ser liberada después de cada ciclo o página impresa. El cartucho y luego volverá a la "lista" de posición, y el cable de alimentación de papel mecanismo debe ser levantado otra vez. La impresora imprime en el cubreobjetos colocado en el centro de la etapa de impresión en el paso 5,2 (ver Figura 2). 6. Resultados representativos </ P> Los resultados representativos del proceso de conversión de un Deskjet serie, fuera de la plataforma HP-500, estándar HP 26 cartuchos de la serie va a crear una impresora con la capacidad de las soluciones de impresión móviles para muchos tipos de análisis como se dijo antes. La impresora completado después de la conversión se muestra en la Figura 3, con una etapa de impresión para colocar el cubreobjetos sobre microscopio. La impresora puede ser útil en el análisis en muchos campos, incluyendo pero no limitados a: la mecánica de células individuales, ingeniería de tejidos, transfección génica, micropatterning biosensor, y terapias directas de células 1-10, 16-22. En este ejemplo, una impresora HP Deskjet 500 y HP 26 cartuchos de tinta de la serie se modificaron para bioprinting. Utilizando esta configuración de la impresora con un bioink que consta de una suspensión de células de fibroblastos en una solución de monómero g-actina, las células se imprimen sobre cubreobjetos de vidrio para microscopio. Figura 1 ilustra RES representativos ULTS de células de fibroblastos impresos, que muestran incorporados monómeros de actina fluorescentes. Los resultados se obtuvieron en un ambiente controlado aséptico en la cual las células se imprimen en patrones adaptable. El patrón usado en este ejemplo fue creado en Microsoft Word (Figura 2). Este patrón creado una línea continua de la solución de impresión a través de la mayoría de los portaobjetos de microscopio. Figura 4 muestra la línea recta en la que están mutuamente la bioink y las células depositadas. Cabe señalar que, inmediatamente después de la impresión, hay un aumento de la fluorescencia de fondo porque la solución bioink, en el que las células se suspenden, contiene monómeros libres de exceso de actina fluorescentes. Esta fluorescencia de fondo disminuye significativamente tras la adición de medios de crecimiento en las células (Figura 1), que se lava el exceso de monómero a partir del sustrato. ad/3681/3681fig1.jpg "/> Figura 1. Las imágenes representativas de los fibroblastos 3T3 3 horas después de la impresión utilizando la impresora de inyección de tinta modificado. El interior de las células muestran incorporados marcado con fluorescencia monómeros de actina. Las barras de escala representan 50 micras. Figura 2. Diseño utilizado para imprimir bioink. Figura 3. De la impresora después de la conversión con la etapa de espuma de poliestireno. El cable de color naranja en el medio no pasa por el sensor de la palanca de alimentación de papel. Figura 4. Imagen representativa de los fibroblastos 3T3 impresas en una zona de impresión localizada. Imagen de microscopía toma 5 minutos después de la impresión a 20x de aumento. / Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg "/> Figura 5. La imagen de fluorescencia (40x) se toma 3 horas después de la impresión que muestra un fibroblasto con internalizadas monómeros de actina fluorescente. Barra de escala representa 50 micras. Figura 6. Microscopía de fluorescencia (20 aumentos) de una célula tomada 15 minutos después de la impresión. La imagen muestra el G-actina (verde) y el núcleo (azul). De izquierda a derecha: g-actina con Alexa Fluor 488, el núcleo con DAPI, y una superposición de ambos. Figura 7. Microscopía fluorescente que muestra dos fibroblastos en un patrón de línea 3 horas después de la impresión. Imagen a la izquierda muestra la etiqueta fluorescente monómeros de actina dentro de las células. Imagen de la derecha es una superposición del canal fluorescente con la imagen de fondo para mostrar que a pesar depuede haber algunos restos de la diapositiva (en la esquina inferior izquierda), no fluorescente. Las barras de escala representan 50 micras, si no se indica el tamaño de la extrema derecha es un grupo control de no impresas las células se incubaron durante 3 horas con monómeros marcado con fluorescencia. Este control es mostrar que los monómeros no podía penetrar la membrana celular sin permeabilización de la membrana celular mediante impresión.