Оценка GFP слова и жизнеспособность использование Тали на основе изображения Цитометр

1. Окрашивание Клетки с Kit Жизнеспособность Тали – Dead сотовый Красный Реагент Начните эту процедуру с клетками U2OS (Американская коллекция типовых культур), которые были трансдуцированных использованием CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2,0 *. (Примечание: Клетки также могут быть остановлен и ресуспендировали в средней или PBS). Чтобы пятна отмерших клеток с П. И., передача 100 мкл клеток в новую пробирку микроцентрифужных. Обратите внимание, что концентрации 1 х 10 5 до 1 х 10 7 клеток / мл рекомендуется для этого теста, хотя концентрация не должна быть точной. Далее, чтобы пятна отмерших клеток, добавить 1 мкл PI основе Тали мертвых клеток красного реагента. Vortex коротко перемешать. Инкубируйте Тали Мертвого реагента Red Cell и клеточной смеси при комнатной температуре в темном месте в течение 1-5 минут. После инкубации, немедленно приступить к анализу пробы на Тали на основе изображения Цитометр. 2. Выполнение Анализ жизнеспособности клеток ИспользованиеТали на основе изображения Цитометр Цитометр Тали используются одноразовые пластиковые Тали Сотовая Анализ Слайды, которые конкретно вписывается в цитометр и может провести две 25 мкл образцов в отдельных закрытых камерах (и В). При обработке слайдов, убедитесь, что всегда держите его сторон. Для загрузки слайда, пипетка 25 мкл образца медленно в форме полумесяца область загрузки образцов, заботясь, чтобы избежать формирования пузырьков или назад брызг. Не над или под заливку. Здесь, контрольных клеток (неокрашенные, не трансдуцированных) загружаются в камеру и окрашенных GFP-экспрессирующие клетки загружаются в камере В. контрольном образце поможет определить уровень флуоресценции при анализе данных. Для выполнения анализа жизнеспособности, сенсорный GFP / RFP на главном экране цитометр. Анализ вариантов появится справа. Выберите GFP + жизнеспособности. Далее, чтобы назвать образцом серии, нажмите Имя Теперь </strong>. Затем, используя сенсорный экран, введите имя образца серии, и нажмите Сохранить. (Примечание: Выбрать Название Позже для автоматического назначения имен для каждого образца серии по дате и времени.) После присвоения образца, цитометр Тали автоматически перейдет к Мера экране. Пресс вкладку Фон на половину нижней правой части экрана мера. Далее, с контрольной пробы (А) в сторону от цитометр, вставить слайд в порту погрузки до упора. Не применяйте силу. На фоне экрана, сенсорный Нажмите, чтобы Вставить новый Неокрашенные управления Cell. Слайдов будет автоматически втягивается в цитометр и прямое изображение клетки будут отображаться на экране. Использование фокус ручку, принесите клеток в надлежащее плоскости зрения. Камеры должны быть равномерно темно с ярким ореолом вокруг каждой ячейки (рис. 1, слева). Ячейкаа может быть занижались, когда переход между фоном и краев клеток нечеткие, так что клетка границы четко не определены (рис. 1, Центр). Ячейки могут быть overcounted когда у них есть яркие и темные центры периметров (рис. 1, справа). Для лучшего обзора клеточной популяции, сосредотачиваясь, слайд-красный индикатор кнопки изменения масштаба для 4X или 16X. Как только клетки были приведены в фокусе, сенсорный Нажмите для запуска Неокрашенные управления сотовый для измерения фоновой флуоресценции. Цитометр будет автоматически фиксировать и анализировать изображения образца. Она занимает около 1 минуты для захвата и анализа изображения по умолчанию (9 изображение). Миниатюры каждого поля зрения отображаются как они захватили и индикатор обеспечивает текущие обновления. После захвата изображения завершена, цитометр автоматически извлекается слайдов и содержит данные анализа снимков. Сохраненные данные будут отображаться в выпадающем меню вкладку Фон на цитометр. Образец фона контроль будет присвоен тем же именем, что, учитывая в эксперименте и будут импортированы в выпадающем меню. Примечание: Если фон контроля он не запущен, цитометр автоматически назначает флуоресценции порога. Это может быть изменен вручную после выполнения теста. Для запуска PI-окрашенных трансдуцированных образец, удалить слайд из цитометр, переверните его и снова вокруг его трансдуцированных образца в сторону от инструмента. Пресс Пример вкладки, а затем нажмите Нажмите для вставки нового образца. Когда изображение появляется на экране, используйте ручку настройки изображения для приведения клетки в центре внимания, как раньше. Затем нажмите Нажмите для запуска проб. После захвата изображения завершена, данные анализа появляется на вкладке Образец и цитометр автоматическоесоюзника выбрасывает слайда. Надлежащим распоряжаться Анализ Тали Сотовая Слайд как биологически опасные отходы. Тали Слайды Сотовая анализ не может быть повторно использован. 3. Настройка пороговых значений и Гейтс Как только образец работать, пороги теперь могут быть применены к образцу для перехода к конкретной популяции клеток. Здесь, мы будем корректировать пороги, чтобы определить процент живых и мертвых клеток в GFP-трансдуцированных клеток. Под Пример вкладки, число и процент клеток, экспрессирующих GFP, живых и мертвых клеток, экспрессирующих GFP, общая жизнеспособность, средний размер ячейки, количество ячеек подсчитываются и концентрации клеток отображаются на дисплее. Кроме того, гистограмма участков отображения размера ячейки, зеленая флуоресценция, и красной флуоресценции (PI), отображаются в нижней части экрана. Для установки ворот размер ячейки, сенсорный миниатюрами Размер ячейки, чтобы открыть гистограммы размера ячейки. Хотя культуре клеток редко гebris, другие образцы могут содержать мусор, который больше или меньше, чем клеток. Чтобы исключить этот мусор, слайд-синих кнопок на ползунок, чтобы исключить большие и малые события. Затем, сенсорный Применить к повторный анализ данных и обновления результатов. Далее, чтобы добавить GFP флуоресценции для анализа, сенсорный миниатюрами GFP гистограммы, чтобы открыть его. Слайд синяя полоса установить порог, который находится справа от тусклой пика, используя контрольный образец в качестве ориентира. Это позволяет включить анализ GFP-положительных клеток, но не включают autofluorescent клеток. Аутофлюоресценция часто наблюдается, когда биологических молекул внутри клеток рады. Сенсорный Apply для подтверждения и возврата к предыдущему экрану. Данные, отображаемые под Пример вкладка теперь должна отражать ворота и порогов, установленных для обоих каналов флюоресценции. Далее, для отдельных PI окрашенных клеток из аутофлюоресценция нажмите тОн PI гистограммы на миниатюру для открытых П. И. гистограммы. Опять же, пиком контрольной пробы будут отображаться как серый пик на гистограмме. Красный пик образец флуоресценции. Фоновой флуоресценции отображается в виде пика ближе к 0 значение РФС на этой цитометр. Для устранения фоновой флуоресценции в канале П. И., перемещать синюю кнопку на ползунок для регулировки порога, чтобы исключить пик представляющих фоновой флуоресценции, используя серые пик от контрольного образца в качестве эталона. Сенсорный Apply для подтверждения и возврата к предыдущему экрану. Далее, чтобы визуально подтвердить, что каждая ячейка правильно назначены, выберите захваченных полем зрения для рассмотрения, нажав эскиз изображения в Увеличить вкладке, а затем нажать вкладку Layers. Далее, нажмите GFP или PI кнопку, чтобы отобразить изображение, снятое через это определенный канал. Нажмите ту же кнопку еще раз, чтобы удалить слой с дисплея, или, накладывать слои, сенсорного Несколько кнопку слой. Чтобы определить, каким образом клетки считаются через определенный канал, сенсорный кругов. Клетки, которые были подсчитаны только через светлого поля канал, который не выражают флуоресценции будет обведена синим. Это указывает на то, что именно эта ячейка жить (т.е. PI отрицательный). Клетки, экспрессирующие GFP будет видно в канале GFP, и будет обведена зеленым. Мертвые клетки окрашиваются Мертвого Red Cell будет видно в канале П.И., и будет обведено красным. Клетки учитываться и в красный и зеленый канал будет обведено желтым, это говорит о том, что клетка выражает GFP, но и окрашивали PI и поэтому умер. Иногда, черные кружки появится на экране, это объекты, которые были выявлены, но были исключены из анализа, основанного на размер ячейки. Продолжайте Fiпе настроить порог на флуоресценцию гистограммы, используя шаги, только что описал, пока каждая ячейка, выразив флуоресценции окружен с соответствующим цветом. Все параметры анализа автоматически сохраняются на вкладке Данные. Цитометр Тали может хранить файлы данных из примерно 500 работает образца. Каждый файл хранится в закладке данные доступны для повторного анализа. Выбрав файл из вкладки Данные он будет открыт, и все гистограмм и слои становятся активными. Для архивирования данных и создания отчетов, данные, хранящиеся в цитометр могут быть переданы на компьютер с помощью диска USB. 4. Представитель Результаты: На основе изображения Тали Цитометр был использован для измерения флуоресцентного уровня экспрессии белка в клетках, которые были трансдуцированных с ядерным целевых GFP BacMam построить выражения 2.0. Четыре представителя типов клеток были трансдуцированных (U2OS, 293MSR, HEKn и СНО-S).Для этих клеточных линий, количество ячеек, которые выражали GFP сообщили цитометр Тали и сравнивается с данными из тех же образцов проанализированы на проточный цитометр. Кроме того, клетки были окрашены мертвых клеток красного реагента использованием Kit Тали Жизнеспособность для выявления мертвых клеточной популяции как на цитометр Тали и на проточный цитометр. Графическое представление на рисунке 2 показывает процент от общей численности населения для каждого типа клеток, которые выражали GFP. Эти данные показывают, что цитометр Тали производит данные сопоставимы с данными порожденный поток цитометр. Рисунок 1. Клетки должны быть надлежащим образом сосредоточено до анализа. Тали Сотовая слайды анализ с клеточной концентрации подходят для анализа (1 х 10 5 до 1 х 10 7 клеток рекомендуется). (Слева) в фокусе клетки равномерно гКовчег по всей клетке, с ярким ореолом вокруг каждой ячейки. (CENTER) Ячейки могут быть занижались, когда переход между фоном и краями клетки нечеткие и неопределенные клетки границ (ПРАВЫЙ) клетки, может быть, overcounted, когда они имеют яркий центры и темно периметров. Рисунок 2. Флуоресцентные экспрессии белка данные из Тали на основе изображения Цитометр сравнима с полученных с помощью проточной цитометрии. Бок о бок сравнение расчетных GFP-выражения результатов в 4 различных клеточных линий в жизнеспособных клеток.