タリイメージベースのメ​​ーターを用いたGFPの発現と生存率の評価

1。タリの生​​存キッ​​トと染色細胞 – 死細胞レッド試薬 CellLight核- GFP * BacMam 2.0を使用して形質導入されているU2OS細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション）に、この手順を開始する* （注：細胞はまた、スピンダウンし、培地またはPBSに再懸濁しすることができます）。 PIと死細胞を染色するために、新しいマイクロ遠心チューブに細胞を100μLを転送する。 1 × 10 5〜1 × 10 7細胞/ mLの濃度はこのアッセイのために推奨されていることに注意し、かかわらず、濃度は正確である必要はありません。 次に、死細胞を染色するために、PIベースのタリ死細胞レッド試薬の1μLを加える。軽くボルテックスして混和する。 1〜5分間暗所に室温で距骨死細胞レッド試薬と細胞の混合物をインキュベートする。 インキュベーション後、直ちにタリイメージベースのメ​​ーターでサンプルの分析に進みます。 2。使用して細胞生存率アッセイの実行TALIイメージベースメータータリサイトメーターは、特にサイトメーターに適合し、別の密閉チャンバー（AとB）の2つの25μlのサンプルを保持することができる使い捨てのプラスチック製タリ細胞解析のスライドを使用しています。スライドを取り扱う際は、必ず側面を持ってしてください。 形成気泡やバックスプラッタをしないように注意しながら、徐々に半月状のサンプルのローディング領域にスライド、サンプルのピペット25μLをロードする。塗りつぶしの上または下にしないでください。 ここでは、コントロール細胞（染色、非形質導入）チャンバー内にロードされ、ステンドGFP発現細胞は、対照サンプルは、データを分析するときに自己蛍光のレベルを決めるのを助ける室Bにロードされます。 生死判別試験を実行するには、サイトメーターのホーム画面にGFP / RFPをタッチします。アッセイのオプションは、右側に表示されます。 GFP +生存率を選択します。 次に、サンプルのシリーズに名前を付けること、 今名前を押してください </strong>。その後、タッチスクリーンを使用して、サンプルのシリーズの名前を入力し、Enterキーを保存します 。 （注意：自動的に日付と時間で各サンプルのシリーズの名前を割り当てることが後で名前を選択します 。） サンプルを命名した後、タリサイトメーターは、自動的に測定画面に進みます。 測定画面の右下半分に[背景]タブを押してください。 それが止まるまで次の、コントロールサンプルが（）サイトメーターから離れて直面していると、ロードポートにスライドを挿入する。力を加えないでください。 背景画面で、タッチは、 新しい無染色細胞のコントロールを挿入するときに押します 。スライドは自動的にサイトメーターに引き込まれると、細胞のライブ画像が画面に表示されます。 フォーカスノブを使用して、ビューの適切な面に細胞をもたらす。細胞は各細胞の周りに明るいハロー（図1、左）と一様に暗くしてください。 セル背景とセルのエッジ間の遷移がぼやけているときのはセルの境界線がよく（図1、センター）が定義されていないように、undercountedされることがあります。彼らは明るい中心と暗い周囲（図1、右）があるときに細胞がovercountedされることがあります。 焦点を当てながら、より良い細胞集団を表示するには、4Xまたは16Xに赤のズーム表示ボタンをスライドさせます。 細胞が焦点に持ち込まれていると、バックグラウンドの蛍光を測定するために無染色細胞の制御を実行するためのプレスに手を触れない。 サイトメーターは、自動的にサンプルの画像をキャプチャして分析します。それは、デフォルト（9画像）モードで画像をキャプチャし、分析するために約1分かかります。 ビューの各フィールドのサムネイルは、それらが取得されると表示され、プログレスバーが進行中のアップデートが提供されている。イメージのキャプチャが完了したら、サイトメーターは、自動的にスライドを排出し、撮影画像の分析からデータを提供します。 保存されたデータは、サイトメーター上で[背景]タブのドロップダウンメニューに表示されます。バックグラウンドのコントロールのサンプルは、実験に与えられたものと同じ名前を割り当てられると、ドロップダウンメニューにインポートされます。注：バックグラウンドのコントロールが実行されていない場合は、フローサイトメーターは、自動的に蛍光しきい値を割り当てます。これは、手動で分析を実行した後で変更することができます。 PI染色形質導入サンプルを実行するには、フローサイトメーターからスライドを削除し、それを180度転換すると形質導入サンプルは楽器から離れて直面していると、それを再挿入します。 サンプルのタブを押して、 新しいサンプルを挿入するためのプレスに手を触れない。画面にイメージが表示されたら、以前のように焦点に細胞を持って来るために画像の調整ノブを使用してください。その後、 サンプルを実行するを押して手を触れない。 イメージのキャプチャが完了したら、分析からのデータは、 サンプルのタブとサイトメーター自動]の下に表示されます同盟国は、スライドを排出します。 適切なバイオハザード廃棄物としてタリ細胞分析のスライドを処分。 TALI細胞解析のスライドは再利用できません。 3。しきい値の設定とゲイツサンプルが実行されれば、しきい値は、現在、特定の細胞集団上で自宅にサンプルに適用することができます。ここで、我々は、GFP遺伝子導入細胞の生細胞と死細胞の割合を決定するしきい値を調整します。 サンプルタブの下で、GFPを発現する細胞、GFP、総生存率、平均セルサイズ、計数した細胞数、および細胞濃度を表現する生細胞と死細胞の数と割合が表示されます。 さらに、セルサイズ、緑色蛍光、および赤色蛍光（PI）を表示するヒストグラムプロットは、画面の下部に表示されます。 セルサイズのゲートを設定するには、セルサイズのヒストグラムを開くにはセルサイズのサムネイル ​​をタッチします。培養細胞はほとんどDを持っていないがebris、他のサンプルは、セルよりも大きいまたは小さい破片が含まれている場合があります。 この残骸を除外するには、大小のイベントを除外するには、スライダーバーの青色のボタンをスライドさせます。その後、再解析データに適用し、結果を更新触れない。 次に、分析するためにGFPの蛍光を追加するには、それを開くためにGFPのヒストグラムのサムネイルをタッチします。ガイドとして、コントロールサンプルを使用して、ちょうど最も暗いピークの右側に閾値を設定するには、青色のバーをスライドさせます。 これによって、解析がGFP陽性細胞を含むが、自家蛍光細胞を除外することができます。細胞内の生体分子が励起されるときに自家蛍光が頻繁に観察される。 確認し、前の画面に戻るには[適用]をタッチします。 サンプルのタブの下に表示されるデータは、現在、両方の蛍光チャネルに設定されたゲートとしきい値を反映している必要があります。 次に、自家蛍光からPI染色された細胞を分離するために、Tキーを押し彼は、PIのヒストグラムのサムネイル ​​は、PIヒストグラムを開きます。 もう一度、コントロールサンプルのピークがヒストグラム上で灰色のピークとして表示されます。赤色ピークは試料の蛍光です。バックグラウンドの蛍光は、このサイトメーターで0 RFU値に最も近いピークとして表示されます。 PIチャネルにおけるバックグラウンド蛍光を除去するために、基準としてコントロールサンプルから灰色のピークを使用して、バックグラウンドの蛍光を表すピークを除外するしきい値を調整するスライダバーにある青色のボタンを移動します。確認し、前の画面に戻るには[適用]をタッチします。 次に、視覚的に各細胞が適切に割り当てられていることを確認し、その後レイヤーのタブを押すと、[ズーム]タブで画像のサムネイル ​​を押して、レビュー用のビューのキャプチャされたフィールドを選択します。 次に、その特定のチャネルを介してキャプチャ画像を表示するために、GFPまたはPIのボタンを押してください。ディスプレイからレイヤーを削除するには、もう一度同じボタンを押す、または、レイヤーを重ね合わせ、複数レイヤのボタンをタッチします。 細胞が特定のチャネルを介してカウントされる方法を特定する、タッチサークル 。蛍光を発現していない唯一の明視野チャネルを介してカウントされた細胞は、青色の丸で囲まれる。これは、その特定のセル（つまりPI陰性）のライブであることを示します。 GFPを発現する細胞は、GFPのチャンネルで見られるだろう、と緑の丸で囲まれる。死細胞のレッドで染色された死細胞がPIのチャンネルで見られるだろう、と赤の丸で囲まれる。 赤と緑のチャンネルの両方で計数した細胞は、黄色の丸で囲んだされる、これは細胞がGFPを発現することを示しているだけでなく、PIで染色し、そのためデッドです。 時折、黒い丸が画面に表示される、これらは特定されているオブジェクトですが、セルサイズに基づいて分析から除外されています。 fiに引き続きNEチューン蛍光を発現している各セルは、適切な色で丸で囲まれるまで、ここで説明した手順を使用して、蛍光ヒストグラムのしきい値。 すべての解析パラメータは、自動的にデータのタブの下に保存されます。タリサイトメーターは、約500サンプルの実行からデータファイルを格納することができます。 データのタブに保存されている各ファイルには、再分析可能です。 [データ]タブからファイルを選択することで、それが開き、すべてのヒストグラムとのレイヤーがアクティブにされます。 アーカイブデータにしてレポートを生成、サイトメーターに格納されたデータはUSBドライブを使用してコンピュータに転送される場合があります。 4。代表的な結果： タリイメージベースのメ​​ーターは核をターゲットとしたGFP BacMam 2.0発現構築物で形質導入した細胞の蛍光タンパク質の発現レベルを測定するために使用されていました。 4つの代表の細胞型が（U2OS、293MSR、HEKn、およびCHO – S）導入した。これらの細胞株の場合は、GFPを発現した細胞の数は、タリサイトメーターによって報告され、フローサイトメーターで分析した同じサンプルからのデータと比較した。さらに、細胞は距骨のメーターで、フローサイトメーターで両方死んだ細胞集団を識別するためのTALI生存キットを用いて死細胞レッド試薬で染色した。 図2のグラフィック表現は、GFPを発現していた各細胞型のための総人口のパーセントを示しています。これらのデータはTALIサイトメーターはフローサイトメーターによって生成されるデータに匹敵するデータを生成することを示している。 図1。細胞は適切に分析前に集中するべきである。分析のために適切な細胞濃度と距骨細胞分析のスライドは、（1 × 10 5〜1 × 10 7個の細胞が推奨されている）。（左）オートフォーカスでは細胞は一様にDか各セルの周りに明るいハローを持つ細胞全体に箱舟、（CENTER）は明るいがあるとき、背景とセルの端との間の遷移があいまいであり、細胞が未定義の境界を持っている（右）のセルは多分overcounted時に細胞がundercountedされることがありますセンターと暗い周囲。 図2。タリイメージベースのメーターからの蛍光タンパク質の発現データは、フローサイトメトリーを使用して得られたものと同等です。生存細胞における4つの細胞株で計算されたGFP -発現の結果を並べて比較。