تقييم التعبير GFP واستمرار استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات
Summary
هذا البروتوكول يصف كيفية تنفيذ بقاء الخلية المقايسات والتعبير مضان باستخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات.
Abstract
ويتم الحصول على عادة وحيدة الخلية والمعلومات السكانية إما عن طريق الفحص المجهري أو التدفق الخلوي مضان. ومع ذلك ، فإن هذه طريقتين تقديم معلومات مختلفة. التدفق الخلوي يعطي كمية متعددة بارامترية من المعلومات حول الخصائص الفيزيائية وتلطيخ أو التعبير ، ولكن لا يسمح التصور. قائمة بذاتها المجهري مضان توفر بيانات مرئية ، لكنها لا تسمح للقياسات الكمية المباشرة 1.
الصورة القائمة على الخلوي الجسور الفجوة بين هاتين الطريقتين ، وتمكين التصور سريعة والتحليل الكمي في وقت واحد الالاف من الخلايا في السكان غير متجانسة 2. هنا ، نقدم طريقة لأداء وقابلية الخلية الخضراء الفلورية المقايسات البروتين التعبير (GFP) باستخدام عداد الكريات طالي يستند إلى صورة 3. الصك تالي هو مقايسة الفوق 3 قناة (حقل مشرق ، ومخضر ، مضان أحمر) منصة الخاص بشركةمزايا عديدة عبر التمرير التدفق الخلوي ، والفحص المجهري مضان. في عداد الكريات تالي هو اقل كلفة ، ويأخذ مساحة أقل مقاعد البدلاء ، وتتطلب صيانة أقل ، ولقد تم تبسيط تدفق العمل بحيث العملية والتحليل هو أبسط من ذلك بكثير وأسرع. في عداد الكريات طالي غير قادرة على أداء مجموعة من الخلية المقايسات مقرها التعليق ، بما GFP والحمراء ببروتين التعبير (RFP) ، وموت الخلايا المبرمج 4-6 خلية تحليل الجدوى مع يوديد propidium (PI) 7-11.
هنا ، ونحن لشرح استخدام الأداة طالي في أداء مقايسة بقاء الخلية في الخلايا معربا عن GFP. هي ملطخة GFP – transduced الخلايا باستخدام أدوات الاستمرارية طالي — الميت الاحمر الخلية. وpipetted ثم الخلايا في تحليل طالي الشرائح الخلوية وتحميلها في عداد الكريات. يتم التقاط مجال مشرق ، ومضان أحمر وأخضر مضان الصور وتحليلها باستخدام خوارزميات مقايسة محددة. ثم يتم إنشاء رسوم بيانية لعرض حجم الخلية ، PI fluorescence الكثافة ، وGFP كثافة مضان. ويمكن بعد ذلك أن هذه المعلمات thresholded إلى منزل على السكان في خلية معينة.
وجنبا إلى جنب مقارنة من عداد الكريات طالي يستند إلى صورة والتقليدية التدفق الخلوي يدل على أن الطريقتين توفير بيانات قابلة للمقارنة بشأن سلامة الخلية وبروتين تعبير. ومع ذلك ، فإن الصك طالي يوفر معلومات بصرية إضافية حول السكان الخلية التي لا يمكن الحصول عليها باستخدام عداد الكريات التدفق.
Protocol
Discussion
وقد فصلنا مجرد إجراء لأداء بحساب الجدوى وتقييم التعبير GFP باستخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات. باستخدام نفس الإجراء ، وهذا هو عداد الكريات قادرة على أداء عدد من فحوصات أخرى ومنها : موت الخلايا المبرمج ، وخلية التحليل RFP جدوى استخدام المنظمات غير transduced الخلايا.
أصبحت المقايسات Fluorometric من بقاء الخلية ، والتعبير الجيني والخلايا الرئيسية في منهجيات البحوث الطبية الحيوية 7-12. في الأجهزة ، في الماضي منفصلة تم استخدامها للحصول على معلومات كمية والبصرية حول الخلايا. في حين تم المعلومات الكمية حول الخلايا ضمن مجموعة من السكان غير متجانسة حصل من خلال استخدام التدفق الخلوي ، وقد تم جمع المعلومات المرئية أو نوعية من خلال استخدام المجهر مضان 1-4. هنا ، نقدم التكنولوجيا التي تسد الفجوة بين السكان ودراسات الخلايا الفردية. استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات والكمية داويمكن جمع البيانات وتا الخلايا البصرية حول الخلايا الفردية أو السكان الخلية في وقت واحد. يمكن استخدام أداة طالي لمجموعة من التطبيقات بما في ذلك تقييم التعبير الجيني ، المقايسات موت الخلايا المبرمج ، ودراسات نجاعة الأدوية ، وتقييم تطور المرض.
ويستند إلى صورة طالي يلتقط عداد الكريات مشرق وتحليلات ميدانية ، مضان أحمر والصور مضان أخضر ، مما يتيح الحصول على معلومات عن المجموعات السكانية الفرعية من الخلايا. على سبيل المثال ، في هذا الاختبار ، كنا قادرين على التمييز بين الخلايا الميتة من الخلايا الحية داخل GFP ، معربا عن سكان الخلية باستخدام صبغة الأحمر الميت الخلية. وهذا يعطي دقة في قياس خلايا قابلة للحياة معربا عن GFP ، ويحدد عدد السكان من الخلايا يمكن استخدامها لمعالجة المصب. ومن المهم أن نلاحظ أن الخلايا الميتة في عدد السكان يمكن أن تنشأ من مصادر مختلفة ، بما في ذلك موت الخلايا الطبيعية في الثقافة أو موت الخلية الناجمة عن الظروف البيئية (على سبيل المثال ، أو بحكم trypsinizationATH الناجم عن الأسلوب ترنسفكأيشن / تنبيغ المختار).
نحن هنا لشرح استخدام عداد الكريات طالي U2OS مع الخلايا. لا يمكن أن يؤديها أساليب مماثلة باستخدام خلايا معظم الثدييات والحشرات. لكل خط الخلية ، أنتجت كمية البيانات عداد الكريات طالي GFP التعبير ، التي هي غير ممكنة مع الفحص البصري من الخلايا باستخدام المجهر مضان القياسية. على الرغم من أن هذه النتائج قابلة للمقارنة مع التدفق الخلوي ، يتم جمعها في جزء من الوقت. في عداد الكريات قادر على الفرز بين الخلايا بدقة 5 ميكرون إلى 60 ميكرون في القطر ، وبشكل مثالي في تركيز 1 × 05-1 أكتوبر الخلايا 7 × 10 / مل.
من المهم أن نشير إلى أن معظم البروتوكولات تلطيخ القياسية ، بما في ذلك البروتوكول خلية تلوين الأحمر الميت الموصوفة هنا ، استخدم يوديد propidium للتمييز بين الخلايا الحية والميتة. هذا يمثل تحديا عند تقييم الجدوى في الخلايا التي تم permeabilized عن شaining علامات داخل الخلايا ، حيث سيكون وصمة عار PI مع أي خلية غشاء خطر. حيث يمكن تحليل أي صبغة الفلورسنت أو البروتين الذي يمكن اكتشافه مع القنوات مضان أخضر أو أحمر على عداد الكريات يستند إلى صورة تالي ، قد الدراسات المستقبلية استكشاف استخدام الأصباغ البديلة ، مثل الأمينات الأصباغ بقاء رد الفعل 4. ووجدت دراسة عام 2006 من قبل وآخرون Perfetto (12). هذه الأصباغ لتكون سهلة الاستخدام وقابلة للتكرار في تمييز السكان الخلية الحية والميتة.
علما بأن طالي والقيود فيما يتعلق أنواع المقايسات أنها يمكن أن تؤدي. على سبيل المثال ، لأن الهدف المستخدمة من قبل الصك 4X ، وتقتصر عمليات الفرز على أنواع أكبر خلية : شبه الخلوية هياكل مثل الميتوكوندريا أو حويصلات ، ولا يمكن أن يكون كميا الخلايا البكتيرية. نلاحظ أيضا أن تقتصر قنوات الكشف في تالي إلى fluorophores التي سوف تثير وتنبعث منها داخل القنوات. بينما YFP ومشرق mCherry ج إشاراتيتم الكشف عن ، يمكن باهتة إشارات mCherry لا. أخيرا ، طالي التحليلات فقط الخلايا في التعليق. فإنه لا يحسب بدقة خلايا الانضمام إلى شريحة. وعلاوة على ذلك ، في حين أن هناك قدرة محدودة لفرز الخلايا التي تتشكل بصورة غير نظامية ، بما في ذلك بعض الخمائر والخلايا الأولية.
بالإضافة إلى ذلك ، سوف تتناول الدراسات المستقبلية المحتمل استخدام هذا النظام في تقييم التعبير من علامات داخل الخلايا. يمكن التحقق من الأصباغ الفردية للتداخل مع القنوات الطيفية المجاورة ، وذلك باستخدام أداة لInvitrogen SpectraViewer الانترنت ( www.invitrogen.com / spectraviewer ). نظرا لحداثة هذه التكنولوجيا ، ومجموعة كاملة من التطبيقات لم يتم اكتشافها.
باختصار ، صورة القائم على طالي عداد الكريات تظاهر هنا يقدم تكنولوجيا جديدة تسمح لتصور في وقت واحد وتحليل للسكان الخلية ، مما يتيح تقييم الخلايا الفردية ، وكذلك سلل السكان في شكل التعاقد مع سير عمل بسيطة.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 |
| U2OS cells |
Riferimenti
- Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy. Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).
- Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry. Scanning. 33, 33-40 (2011).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-654 (2002).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Koopman, G. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84, 1415-1420 (1994).
- Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests. J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).
- Jones, K. H., Kniss, D. A. Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture. J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).
- Dell’Arciprete, R. High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry. J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).
- Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
