Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ (LNA flux FISH): une méthode d'bactérienne détection de l'ARN petits

1. Sondes LNA & design expérimental Conception des sondes LNA qui sont le complément inverse de votre petit ARN transcrits / ARNm ou les ont conçus sur mesure au www.exiqon.com . Si vous utilisez l'option design personnalisé, vous connaîtrez la séquence, mais pas le modèle de dopage LNA. L'ajout de chaque résidu de LNA dans un ADN ou d'ARN oligonucléotides résultats par une augmentation de T m comprise entre deux et 10 ° C pour l'hybridation d'un duplex ARN LNA-14. Idéalement, les sondes LNA conçu devrait être entre 20-25 nucléotides de long (plus de sondes sont plus difficiles à synthétiser) et ont un Tm comprise entre 85-90 ° C pour l'ARN hybridation. Après la conception de la séquence, l'utilisation de BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ou comparer la séquence de sonde à votre base de données locale pour assurer la sonde est spécifique à votre petit ARN / ARNm d'intérêt. Lors de la commande de la sonde LNA, ajouter une modification à la biotine TEG à l'extrémité 5 'de l'oligonucléotide LNA. La biotinylation est nécessaire pour la post-hybridation coloration avec un conjugué streptavidine-colorant. Il est possible d'ajouter cette modification de l'extrémité 3 'si nécessaire, mais l'addition à l'extrémité 5' est moins cher et devrait se traduire par des rendements plus élevés. Trois contrôles négatifs doivent être inclus dans la méthode: (i) un contrôle "non LNA» dans lequel une sonde LNA n'est pas ajouté au cours de l'étape d'hybridation, (ii) un «sans colorant» de contrôle dans lequel la sonde LNA est hybride à la cibles petit ARN, mais l'événement d'hybridation n'est pas détectée en raison de l'absence du colorant fluorescent, et de contrôle (iii) 'ARNm non exprimé petit ARN /' une qui utilise une sonde LNA qui cible un petit ARN inexistantes ou non exprimées dans l'ordre de surveiller une hybridation non spécifique. La sonde spécifique LNA ici est complémentaire à l'CsrB SRNA et a la séquence 5'-biotine-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 '(monomères LNA dansmajuscules). Après réception du lyophilisé LNA, resuspendre avec une eau sans nucléase à 50 pg / mL et de stocker en 10-20 aliquotes à -20 ° C. Solutions 8% (PFA) paraformaldehye, 10% d'acide acétique dans du PBS: Mélanger 1 ml 32% PFA, 400 ul d'acide acétique, 400 ul PBS 10X, pH = 7,4, et 2,2 ml d'eau sans nucléase. Pour aliquotes congelés, en aliquots à usage unique à -20 ° C sans acide acétique. 60% solution de sulfate de dextrane: ajouter 6,0 g de sulfate de dextrane à un tube conique de 50 ml et ajouter l'eau pour un volume final de 10 ml. Chauffer ce mélange à 65 ° C dans un bain d'eau jusqu'à ce que le sulfate de dextran est dissoute (peut prendre 1-2 heures). D'eau supplémentaire peut être nécessaire d'ajouter tout au long du procédé de solubilisation de maintenir un volume de 10 mL. Aliquoter la solution 60% de sulfate de dextran et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation. 2. Fixation Récolte 1×10 8 cellules de bioluminescents <em> Vibrio campbellii ou votre bactéries d'intérêt et de les transférer dans un tube de 1,5 ml. Cette quantité de cellules fournit suffisamment de matériel de départ pour quatre flux POISSONS échantillons (un échantillon spécifique de sonde LNA et trois contrôles négatifs). Additionnel de 1,5 ml aliquotes microcentrifugeuse tube doit être collectées que si d'autres petit ARN / ARNm espèces ont besoin d'être testé. Pellet, les cellules bactériennes par centrifugation à 2300 xg pendant cinq minutes. Jeter le surnageant par pipetage et remettre en suspension les cellules dans 400 ul de PBS 1X. A ce mélange, ajouter 400 ul d'une paraformaldehye 8% (PFA) et 10% d'acide acétique dans une solution saline tamponnée de phosphate 1X (1X PBS), bien mélanger, et laisser incuber pendant 10 minutes à 25 ° C le mélange une fois après cinq minutes. Toutes les incubations, sauf indication contraire, sont effectuées dans un porte-tube chauffé. La solution PFA doivent être préparés frais ou d'occasion à partir aliquotes congelées après l'addition d'acide acétique. Paraformaldéhyde est un fixateur de réticulation que hPEL afin de préserver la morphologie cellulaire et de conserver l'ARN intracellulaire. Pellet les cellules de ce mélange par centrifugation à 4500 xg pendant deux minutes et retirer le surnageant par pipetage. Toutes les étapes à venir qui nécessitent une centrifugation devrait utiliser les mêmes paramètres (7K, 2 min). Il est important de noter que les surnageants après centrifugation doit être retiré par pipetage et pas de décantation. Laver les cellules deux fois avec 400 ul de PBS 1X et resuspendre le culot cellulaire final dans 400 ul de PBS 1X. Les cellules sont désormais fixes et peuvent être conservés à 4 ° C dans 400 ul de PBS 1X pour un maximum de sept jours. 3. Traitement de pyrocarbonate de diéthyle Préparer 400 ul d'une solution à 0,1% du diéthyl pyrocarbonate (DEPC) dans du PBS 1X (400 pl de cette solution est nécessaire pour chaque échantillon à tester afin d'échelle en conséquence). La solution DEPC doit être préparé à partir d'un stock de DEPC. Le traitement DEPC inactive RNases par carbethoxylation et diminue lasignal de fond. Ajouter 400 ul de la solution de 0,1% DEPC à chaque échantillon de cellules bactériennes fixées et bien mélanger par pipetage. Incuber ce mélange à 25 ° C pendant 12 minutes. Laver les cellules deux fois avec 400 ul de PBS 1X, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant. 4. Perméabilisation Ajouter 1,0 mg de lysozyme à 1 mL de tampon Tris-EDTA (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) pour un 1,0 mg / ml solution. Cette solution doit être préparé. Ajouter 800 ul de 1 mg / ml solution de lysozyme dans les cellules, bien mélanger par pipetage et incuber à 25 ° C pendant 30 minutes avec mélange occasionnel. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. Le lysozyme agit comme un réactif de perméabilisation en hydrolysant le présent peptidoglycane dans les parois des cellules bactériennes. Préparer un 3,0 mg / ml solution de protéinase K dans du tampon TE. Cette solution doit être préparé à partir d'un stock de 20 mg / ml de protéinase K qui est stocké à -20 ° C.Protéinase K est une sérine protéase qui digère une variété de protéines et contribue à l'accessibilité des sondes et des réactifs à l'ARN. Ajouter 800 uL de la g 3.0 / ml protéinase K solution au culot cellulaire et bien mélanger par pipetage. Incuber à 25 ° C pendant 15 minutes avec vortex à mi-parcours de l'incubation. Pellet cellules (7K, 2 min), éliminer le surnageant et laver les cellules une fois avec 400 ul de PBS 1X. Après avoir retiré le surnageant du lavage, remettre les cellules dans 400 ul de PBS 1X et ajouter 100 ml de la remise en suspension dans quatre nouveaux microtubes 1,5 ml. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. 5. Hybridation Préparer 100 uL de tampon d'hybridation (HB) pour chaque échantillon. Le HB est constituée de formamide à 50% en volume, 10% de sulfate de dextrane en masse (ajouter 16,7 ul de la solution de sulfate de dextran 60% pour chaque uL 100), solution 1X Denhardt, 50 phosphate de sodium pH 7,0,Citrate de sodium 2X (SSC), 20 pg d'ADN de sperme de saumon cisaillé (SSSD) et 20 mg ARNt de levure. Chacune des composantes de l'HB a un but différent. Le formamide abaisse la température de fusion du duplex d'acides nucléiques permettant ainsi aux dénaturation de l'ARN et en minimisant les dommages cellulaires. Sulfate de dextran est utilisé comme un volume hors de polymère pour concentrer la sonde et d'augmenter le taux d'hybridation. Solution Denhardts, la levure et les ARNt SSSD servir des agents bloquants pour réduire la liaison non spécifique. Dans chacune des cellules remise en suspension contenant 1,5 ml microtubes, ajouter 95 uL HB et uL 5.0 du petit ARN / ARNm spécifiques de LNA [20 pmol de LNA concentration spécifique finale] ou de l'eau (pour le contrôle LNA pas de négatif). Par exemple: Tube de 1 à 95 uL HB + 5,0 uL petit ARN / ARNm sonde spécifique Tube de 2 à 95 uL HB 5,0 + uL petit ARN / ARNm sonde spécifique (contrôle négatif "sans colorant") Tube de 3 à 95 uL HB + 5,0 uL petit ARN/ ARNm de la sonde («non-exprimé petit ARN / ARNm« témoin négatif) Tube de 4 à 95 uL HB + 5,0 uL d'eau (contrôle négatif "non LNA») Incuber tous les quatre échantillons à 60 ° C pendant 60 minutes. La température d'hybridation dépend de la sonde LNA m (s) T et devrait être fixé à environ 30 ° C en dessous de la Tm prédit pour le recuit ARN. Tant la température d'hybridation élevée et le formamide dans les HB assure la dénaturation de la structure secondaire de la SRNA ou ARNm d'intérêt. 6. Post-hybridation lave Après l'hybridation, ajoutez 1,0 ml à 0,1 X SSC avec 0,1% de Tween-20 (SSCT) pour le mélange d'hybridation. Cela est nécessaire pour permettre aux cellules d'être retiré de la solution d'hybridation visqueux. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. Ajouter 200 ul de 50% de formamide, 2X SSC, 0,1% Tween-20 à l'culots cellulaires, mélanger soigneusement et Incubmangé pendant 30 minutes à 65 ° C dans un bloc de chauffage. Ajouter 1 mL 0,1 X SSCT au mélange, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant. Ajouter 500 uL SSCT 0,1 X pour remettre les cellules et incuber pendant 40 minutes à 65 ° C dans un bloc thermique. Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. 7. Blocage et coloration Préparer le tampon de blocage (BB) et la solution de coloration streptavidine-colorant. Préparer une solution 1X BB à partir d'un stock de 5X (disponible dans le commerce, voir réactifs). Pour chaque ensemble de quatre tubes, préparer 1,2 ml 1X BB. Ajouter 200 ul 1X BB au culots cellulaires, resuspendre et incuber pendant 30 minutes à 25 ° C. Un colorant streptavidine conjuguée est utilisé pour détecter les sondes LNA biotinylé. Alors que le blocage, préparer une solution de 2 pg / ml DyLight 488 streptavidine ou votre désirée colorant streptavidine conjugué 1X BB pendant 30 min (pour trois échantillons, faire 300 uL). Après Incubtion avec 1X BB, un culot cellulaire (7K, 2 min) et retirer le surnageant. Ajouter 50 uL de la solution de streptavidine-teinture pour les culots cellulaires, bien mélanger, et laisser incuber pendant 12 minutes à 25 ° C avec un mélange constant sur un vortex ou dans un thermomixer. Pour les «sans colorant» de contrôle, ajouter 50 ul de tampon 1X bloquant uniquement. Pour le reste du protocole, de protéger les tubes de lumière en utilisant du papier d'aluminium. Laver les cellules une fois avec 500 uL de tampon SSCT 0,1 X et une fois avec 400 ul de PBS 1X avec 0,1% de Tween-20 (PBST). Pellet cellules (7K, 2 min) et retirer le surnageant. Après les premières conjugué streptavidine-coloration, le signal est amplifié par l'introduction d'un anti-streptavidine biotinylé anticorps au conjugué streptavidine-dye et coloration une seconde fois avec la streptavidine-dye augmentant ainsi le signal de sortie par hybridation de sonde LNA (figure 2) . Ajouter 100 ul de 1 pg / mL biotinylé anti-streptavidine anticorps dans du PBS 1X, resuspend les cellules et incuber à 25 ° C pendant 30 minutes avec mélange occasionnel. Pellet cellules (7K, 2 min), éliminer le surnageant et laver deux fois avec 400 uL PBST 1X. Ajouter 50 uL de la 2 mg / ml de streptavidine-dye solution pour les cellules, bien mélanger, et laisser incuber pendant 12 minutes à 25 ° C avec un mélange constant sur un vortex ou dans un thermomixer. Pour les «sans colorant» de contrôle, ajouter 50 ul de tampon 1X bloquant uniquement. Laver les cellules une fois avec 500 uL de tampon SSCT 0,1 X et une fois avec 400 uL PBST 1X. Resuspendre les cellules dans 200 uL PBST 1X et conserver à 4 ° C jusqu'au moment de l'analyse par cytométrie de flux. Pour les plus petites cellules bactériennes régler le débit de ralentir pour diminuer la taille du cœur. En outre, pour les cytomètres de flux avec l'attaquant seuils seuil de dispersion, la coupure doit être aussi basse que possible pour assurer les petites cellules bactériennes sont détectées. Pour DyLight 488 de détection, le cytomètre de flux doit être équipé d'un laser à 488 nm et d'émission standardfiltres pour FITC. Au moins 2×10 4 événements devraient être collectées. Pour la compatibilité avec cytomètres équipés de lasers différents, d'autres streptavidine conjuguée à des fluorophores peut être utilisé pour ce protocole. 8. Les résultats représentatifs Un exemple de cellules qui sont fixées et perméabilisées efficace est indiqué dans le dot plot de cytométrie en flux sur la figure 3A. Lorsque les conditions décrites ci-dessus pour la perméabilisation, la population cellulaire est petite et homogène indiquant agrégats de cellules rares. Lorsque supérieur (5 mg / ml) des concentrations de lysozyme sont utilisés, les cellules sont plus susceptibles d'agréger et de présenter des valeurs de dispersion accrue de l'avant, indicatifs de particules plus grosses (figure 3B). Un exemple de données de cytométrie en flux à partir d'un flux de succès LNA-FISH expérience est montré dans la figure 4. L'histogramme montre la détection spécifique d'un petit ARN cible avec trois contrôles négatifs.Le «sans colorant» contrôle négatif produit le moins de fluorescence, suivie par le «non LNA» et «non-exprimé petit ARN 'contrôles négatifs. Enfin, l'échantillon avec la sonde petit ARN spécifiques de LNA qui produit le plus de fluorescence. Une fois la méthode et les sondes LNA sont validés de cette manière, des expériences complémentaires peuvent être conçus pour surveiller les changements dans le signal petit ARN au cours du temps, en réponse à des mutations ou des conditions de culture variées, etc Figure 1. Représentation du schéma d'ensemble d'un flux de LNA-FISH expérimentation pour la détection de la SRNA bactérienne. Figure 2. Coloration et l'amplification des flux de LNA-FISH signal. a) L'hybridation de la sonde biotinylée LNA. b) Coloration avec les fluorescents DyLight 488 conjugué streptavidine. c) La liaison de l'biotinylé anti-sd'anticorps à l'treptavidin DyLight 488 streptavidine. L'anticorps peut se lier streptavidine grâce à son site de liaison antigénique ou peut être lié par la streptavidine à travers ses résidus de biotine. d) L'amplification du signal par une coloration plus loin avec l'fluorescentes DyLight 488 conjugué streptavidine. Figure 3. Parcelles de cytométrie en flux de point montrant l'avant par rapport aux résultats d'une diffusion latérale) 1 mg / ml de lysozyme, 3 pg / ml de protéinase K perméabilisation et b) 5 mg / ml de lysozyme, 3 pg / ml de protéinase K perméabilisation. Figure 4. Analyse de l'histogramme de l'écoulement LNA POISSONS résultats. Le signal fluorescent généré à partir de chaque échantillon est représenté par les quatre traces: noir – petit ARN spécifiques LNA sonde; rouge – contrôle négatif "non-exprimée petit ARN; bleu – contrôle négatif" non LNA; violet -Contrôle négatif "sans colorant".