Gene Transfer per l'orecchio del mouse Sviluppo Inner<em> In Vivo</em> Elettroporazione

L'orecchio interno dei mammiferi ha 6 epiteli sensoriali distinti: 3 creste in ampolle dei canali semicircolari, macule nel utricolo e sacculo, e l'organo del Corti nella coclea a spirale. Le creste e macule contengono cellule ciliate vestibolari che trasducono stimoli meccanici per la pongono al servizio della speciale senso di equilibrio, mentre le cellule uditive dei capelli in dell'organo del Corti sono i trasduttori primari per l'audizione ^1. Il destino specifica cella in questi epiteli sensoriali e morfogenesi dei canali semicircolari e la coclea hanno luogo durante la seconda settimana di gestazione nel topo e sono in gran parte completati prima della nascita ^2,3. Studi sullo sviluppo dell'orecchio interno del mouse sono regolarmente condotti da raccolta embrioni transgenici in diverse fasi embrionali o post-natale al fine di conoscere le basi molecolari di cellulare e / o morfologica fenotipi ^4,5. Ipotizziamo che il trasferimento del gene per l'orecchio interno del mouse in via di sviluppo in utero </ Em> nel contesto di guadagno-e la perdita di funzione studi rappresenta un approccio complementare alla transgenesi mouse tradizionale per l'interrogatorio dei meccanismi genetici alla base dei mammiferi lo sviluppo dell'orecchio interno ^6.

Il paradigma sperimentale per condurre studi misexpression gene nel topo in via di sviluppo dell'orecchio interno dimostrato qui si risolve in tre fasi generali: 1) laparotomia ventrale; 2) microiniezione transuterine e 3) elettroporazione in vivo. Laparotomia ventrale è una tecnica di sopravvivenza del mouse che permette di esternalizzazione chirurgica dell'utero per accedere sperimentale per gli embrioni impiantati ^7. Microiniezione Transuterine è l'uso di smussati, micropipette capillari di vetro per introdurre plasmide di espressione nel lume della vescicola otica o otocyst. In vivo elettroporazione è l'applicazione di onda quadra, diretti impulsi di corrente per guidare l'espressione plasmidico in ^8-10 cellule progenitrici.

<p class = "jove_content"> Abbiamo precedentemente descritto questa elettroporazione-based tecnica di trasferimento genico e incluso delle note dettagliate su ogni fase del protocollo ^11. Mouse tecniche sperimentali embriologici può essere difficile da imparare dalla prosa e immagini fisse da solo. Nel presente lavoro, dimostriamo i 3 passaggi della procedura di trasferimento genico. La maggior parte critica, abbiamo distribuire microscopia video digitale per mostrare con precisione come: 1) identificare l'orientamento dell'embrione in utero, 2) riorientare embrioni per il targeting iniezioni al otocyst; 3) microinject DNA miscelata con una soluzione tracciante colorante nella otocyst al giorno e 11,5 embrionali 12,5; 4) elettroporare il otocyst iniettato; e 5) embrioni etichette elettroporate per la selezione post-natale alla nascita. Forniamo esempi rappresentativi di successo trasfettate orecchio interno, di una guida pittorica per le cause più comuni di mistargeting otocyst, discutere su come evitare i più comuni errori metodologici e attuali orientamenti per la scrittura di un utero in gene trasferimento degli animali protocollo di cura.