ヒトタンパ​​ク質アトラス内の組織マイクロアレイ、免疫組織化学染色とデジタル化の生産

1。組織マイクロアレイの製造のために組織を準備する方法（アニメーション1） 対応するヘマトキシリン​​染色した組織切片を含む関連ホルマリン固定パラフィン包埋材料（組織または細胞サンプル）を選択します。 組織切片上の関連する領域をマーク。それがパラフィンブロックに対応する新たにカットヘマトキシリン​​染色されたセクションを持つことをお勧めします。 TMAの生産に使用するテンプレートを設計します。そのような全体TMAセクション以上の抗体のカバレッジと切片の問題など、技術的な問題によって引き起こされるアーチファクトを避けるために、テンプレート内のサンプルをランダム化します。オリエンテーションのテンプレートに追加オリエンテーションマーカーを追加します。 テンプレートに従って組織を編成します。 2。手動組織マイクロアレイ製造（撮影のために必須） 組織のコアの標準化された長さを取得できるようにするには、スタイレット、例えば4.5ミリメートル（ 図2）をマークします。 Guidelのサンプルの中心間の間隔のINES： コアの大きさ0.6ミリメートル – 0.8〜1.0ミリメートルコアサイズ1.0ミリメートル – 1.8〜2.0ミリメートルコアの大きさ1.5ミリメートル – 2.0〜3.0ミリメートルコアサイズ2.0ミリメートル – 2.5〜4.0ミリメートルそれはパラフィンの割れを避けるためにパラフィンブロックの各側に2.5〜3.0ミリメートルの余白を残すことをお勧めします。 使用する選択したパンチをマウントします。代わりに、パンチを保持している六角ネジを緩めて、起動します。パンチハブの溝がしっかりとプラスチック製のVブロックの金属棒に対して置かれたときにパンチが正しく配置されます。ネジを締めると金属製のクリップの端が水平であることを確認してください。 受信者のパンチは（代理店のために緑と赤の、特定のマーク）を左に配置する必要があります。ドナーパンチわずかに大きい直径を有する、（ 図3）右側に配置する必要があります（緑と青、代理店の特定にマークされている）。 XY調整ノブを使用してx軸とy軸に沿ってパンチを移動します。右側の調整つまみは、x-軸に沿ってパンチを移動し、左側の調整ノブは、y軸に沿ってパンチを移動します。 調整ノブの両方のデジ​​タルマイクロメータの読み出しがあります。ノブを移動するときにこれらが有効になります。 リセット→ZERO / ABSボタンを押してください。 インチとミリメートルの間でシフト→/ mmのINボタンを押します。 9×8テンプレートの1 mmのパンチを使用する場合は、穴と穴の間のスペースは2.0ミリメートル（穴の中心間で測定）でなければなりません。 カセットを押すとパンチを破壊すると、ブロックにすぎパンチダウンをプッシュしていないことを確認するには、ホルダー内にパラフィンずにカセットを入れて、カセットの下に上記の1ミリメートルに受信パンチの下に位置を設定深度止めねじを使用して、Z-ガイドの左上隅（ 図3）。 ホルダーに受信者のブロックを置き、ネジを固定するために最小のドライバーを使用しています。タイトにネジを締めていないか、またはパラフィンはカセットから緩んで壊れる可能性があります。 受信者のブロックに約5 mm下に受信者のパンチを押して、いったん前後にパンチを回転させるパンチのハンドルを使用します（ 図3）。可能な限りブロックに限りダウンパンチを押すと穴が5ミリメートルの深されます。 スプリングはパンチを上に移動することができるように、徐々に下方に押して圧力を逃がします。パンチを空にしてパラフィンコアを破棄するようにスタイレットを使用しています。 ドナーパンチ（ 図3）に切り替えることタレットに移動します。 受信者のブロックホルダー上のドナーブロック（ 図3）ドナーブロックの橋を配置します。 ドナー穿刺を押してくださいドナーブロックの選択された領域にH。関心のある領域をサンプリングする組織を見つけるためにマークされている対応する、ヘマトキシリン​​およびエオシン染色したスライドを使用しています。手動で左手での位置にドナーブロックを保持し、右手でパンチを押してください。あなたはスタイレットを押さないように注意してください。デプスストップは、ドナーブロックの適切な位置にパンチの動きをブロックしませんので、それは2番目のマークがスタイレット上に表示されているときに押すと停止することが重要である。 一度パンチのハンドルを回転させる（ 図3）。まだドナーブロックの橋の上にドナーブロックを保持しながら、徐々に下方圧力を解放します。 ドナーの組織は、好ましくは、受信者のコアよりも短い0.5 mmのパンチされています。このプロセスは貴重な代表的な組織の損失を回避し、受信者のブロックの表面上のコアの調整アライメントを保証します。 ブリッジとドナーブロックを削除します。作るドナーパンチ（ポイント4）以前に作られた穴に合っていることを確認してください。あなたは、ドナーとレシピエントパンチブロックの穴が整列されていない場合、セットネジを使用して、パンチの位置を調整する必要があります。 その先端は、受信者のブロックの穴の上部に到達するまで、慎重に下にパンチを押してください。この位置を保持しながら、穴に組織のコアを空にするスタイレットを使用しています。コア表面には、ブロック表面に整列である必要があります。 受信者のパンチに砲塔背面に移動します。 XY調整ノブで次の位置に移動します。 配列が完了するまで、上記の点4cとから繰り返します。 全受信者のブロックが終了すると、受信者のブロックホルダーのネジを緩めます。 40分間42°Cのブロックを焼く。スライドガラス上に下向きに切片領域とブロックを置く。試験管ホルダー（または他の適切な建設）とtの場所の上にブロックを使用してスライドガラスを配置し彼はオーブン。焼成後、オーブンから試験管ホルダーを削除して、静かにスライドガラスをなでることで、ブロックの表面を平坦化。 10分間冷却板上にスライドガラスにブロックを置きます。 TMAを通して代表的な組織を確実にするために各50 番目のセクションの品質管理が行われます。 3。どのセクションTMAS（アニメーション2） セクションの転送システム（HM 355S、マイクロモル）をミクロトームを用いて4μmの厚さの切片を切り取ります。システムは、現在のすべてのロータリーミクロトームを使用することができます。システムが統合された転送ブリッジ、温水浴とコントロールユニットを搭載したブレードキャリアで構成されています。ブレードからのセクションでは、水浴に転送ブリッジを介してウェット転写面に滑る。 セクションは、敏感な組織スポット（乳がんや脳のような例えば、脂質の豊富な組織）の融解を避けるために、伸ばした直後に、水浴から取られるべきである。ナンプラーsuperfrostガラススライド上にCEのセクションを参照してください。セクションは、水にしておくことができ時間が使用され、水温ワックスパラフィンのタイプによって異なります。 56から58°C、我々は37から39までの水浴の温度をお勧めします℃の融点を持っているHistoLab製品ABから私たちのラボの使用パラフィンワックス、 一晩室温（RT）で乾燥するためのスライドホルダーにス​​ライドを配置します。 スライドは12〜24時間50°Cで焼いています。あなたは、例えばブラシを使用して手動でブレードから水浴にセクションを輸送する必要がなく、STS microtomを使用します。 4。免疫組織化学のためのテストと滴定手順（アニメーション3） 各抗体は、組織と異なった細胞型の混合物を含む特別に設計されたTMASを使用して標準化された試験手順に供される。目的は、各抗体の個別の最適化された免疫染色プロトコルを評価することである。アリに基づいて最初に1つの希釈、一次抗体のibodyストック濃度がテストされます。このテスト染色の結果は、プロトコルのさらなる希釈と最適化を誘導するために使用されています。 蒸留水にキシレンおよび傾斜エタノールで脱パラフィンと水和は、免疫染色の前に実行されます。 内因性ペルオキシダーゼをクエンチするために、ブロッキングのステップが5分間95％エタノールに0.3％H 2 O 2で実行されます。 熱誘導エピトープ検索（HIER）は125℃で4分間加熱源として圧力ボイラー（Decloaking室、バイオケアメディカル）を使用して、℃、検索バッファのpHを6で実行されます沸騰完了した後、スライドは圧力ボイラーに残っていると90に冷まし℃でHIERの総処理時間は約45分です。 決定的な結果は最初のテストで得られない場合は、さらにテストが観測された染色パターン5に基づいて行われます。パイロット研究では、HPA、ハイスループットセットアップ内に示したそのHIER pH6のが、このようなプロテイナーゼ、電子レンジ、高いか低いpHを有する緩衝液中で煮沸したプレインキュベーションのような他の検索方法はもちろん、使用することができる最も有用な抗原の検索。抗体のインキュベーション時間、抗体希釈液およびジアミノベンジジン（DAB）インキュベーション時間を変更するIHC条件などを変更することにより、染色パターンは、より決定的な結果を与えることができます。 5。染色プログラム、Autostainer 480（サーモフィッシャーサイエンティフィック） すべてのインキュベーションは室温で行われ、このプロトコルは、同じ試薬を使って手動でセットアップとしてでも使用できます。 洗浄バッファーでリンス。 5分間ウルトラVブロックとのインキュベーション。 洗浄バッファーでリンス。 30分間一次抗体とインキュベートした。 洗浄バッファー（X2）ですすいでください。 30分間標識した西洋ワサビペルオキシダーゼポリマーとのインキュベーション。 洗浄バッファー（X2）ですすいでください。 DAB溶液での開発10分間。 洗浄バッファー（X2）ですすいでください。 5分*のメイヤーズヘマトキシリン​​で対比染色。プログレッシブ染色法を使用する場合（例えば、メイヤーズヘマトキシリン​​）強度が時間に依存しない差別化は必要ありません。退行性染色方法などのハリスヘマトキシリン​​は、構造を強調するために組織から過剰の染料を除去するために差別化する必要があります。 水道水*でリンス。 1分*の飽和溶液から1:5に希釈し、炭酸リチウムの水で洗い流してください。 5分*のために水道水ですすぎます。 スライドは、傾斜エタノール中で脱水しており、スライドは（PERTEX、Histolab）封入されているすべての試薬は、スライドごとに300μlの容量で適用されます。 *ステップ10から14はhistostaining器（Autostainer XL、ライカ）で行われており、封入はさらにcoverslipperシステム（自動化されたガラスcoverslipper CV5030、ライカ）で行われます。 6。スキャン方法スライドスライドをスキャンする方法が利用されているデジタルスキャナに依存している、このプロトコルは、自動スキャンシステムアペリオXT（アペリオ·テクノロジーズ）を使用してスライドをスキャンする方法を定義します。のためのヒューマンプロテインアトラスセット·アップ20倍の倍率で組織や細胞のために40倍が使用されます。自動スキャンは、組織の不均一性とTMAに含まれる様々な組織の数に起因するフォーカスの問題が発生する可能性があります。 汚れ、接着剤からスライドガラスを清掃し、カバースリップとセクションの間に気泡を確認してください。スライドマウントの気泡の場合。 ラックのスライドを入れてデジタルスキャナにラックを配置します。 20倍の倍率でTMAをスキャンする時間は約6分です。アペリオからのソフトウェアは、関心のある領域を選択するために使用されます。フォーカスポイントの選択は、ソフトウェア内で自動的に作成されます。手動でスキャンエリアとフォーカスポイントの選択も可能です。 画像時間後生成されたとして、それは、評価およびIHC染色の注釈に使用することができます。画像は実験の結果ファイルとして残っていると議論のために同僚に配布することができ、さらにデータを公開するために使用されます。画像はアペリオから自由に利用可能なソフトウェアで表示することができます。 7。ヒトタンパ​​ク質アトラスやお気に入りの蛋白質を検索する方法を参照しwww.proteinatlas.org。 お気に入りのタンパク質、EnsemblのID、UniProtのアクセッション番号またはHGNC名などのインスリンの名前を入力します。 サマリーページを入力して、正常組織や臓器の要約を下にスクロールします。概要では、膵臓のタンパク質発現を示しています。 "多くの組織データ"をクリックします。あなたはすべての組織、臓器でソート含ま見ることができる正常な組織は表示と入力します。 同じタンパク質に向け3抗体をIHCの結果を表示するには、膵臓をクリックします。ハイテクを表示するには画像上の膵臓をクリックしたGH-解像度はイメージです。 癌組織、細胞、ヒトタンパ​​ク質アトラス内でさらに検証データのタンパク質発現に関する追加情報は、ヒューマンプロテインアトラスのウェブサイトをブラウズして見つけることができます。 8。代表的な結果 アニメーション（1）組織マイクロアレイの製造のために組織を準備する方法はアニメーション1を表示するには、ここをクリックしてください 。 アニメーション2。どのようにセクションのTMASにはアニメーション2を表示するには、ここをクリックしてください 。 アニメーション3。免疫組織化学的手法が説明されています。 アニメーション3を表示するには、ここをクリックしてください 。 図1はHuman Protein Atlasのウプサラ内のプロセスの全体的なスキーム。 組織のコアの標準化された長さ用にマークされた図2。ドナースタイレットは、4.5ミリメートル、例えば。 図3：手動組織マイクロアレイ。 図4生産TMASの異なる品質の例。 （A）の行と列と同様にパラフィンの端までの間に十分なスペースをまっすぐ正しく整列TMA。 （B）コアの一部とTMAもセクショニング推定が困難で得られたエッジに近接しています。 tに焼かれている（C）TMAOOは長い正しいテンプレートを使用せずに折りたたまれたTMAの結果。 図5。ヘマトキシリン·エオシン染色したTMAS。ストレートと整列された列と行を持つ（A）が適切にカットしてください。不良または汚れたブレードを使用して分割する（B）、または圧縮されたセクション（C）につながる可能性があります。 図6：抗体の滴。 （A）リンパ節の反応中心の細胞は、バックグラウンドなしで特定の細胞質の染色（茶色で示されている）の結果を最適滴抗体を示しています。 （B）組織切片は、弱い染色を示しています。一次抗体の濃度が低すぎるか、または標的タンパク質は、免疫染色組織内に存在しない場合はあるとき負または弱い染色が見つかります。 （C）組織切片を一次抗体の濃度が高すぎるの使用に起因するoverstainedされています。 D波及することにより、細胞内局在を決定する困難に箱舟の色の結果は、反応性と偽陽性を渡ります。