Produzione di Microarrays tessuto, colorazione immunoistochimica e digitalizzazione All'interno della Atlas proteina umana

1. Come preparare i tessuti per la produzione Tissue Microarray (Animazione 1) Selezionare rilevante materiale paraffina fissato in formalina incorporato (campioni di tessuto o cellula), compresa la corrispondente sezione di tessuto tinto ematossilina. Segna un'area rilevante del sezione di tessuto. Si raccomanda di avere una sezione appena tagliata tinto ematossilina corrispondente al blocco di paraffina. Progettare il modello utilizzato per la produzione di TMA. Randomize i campioni all'interno del modello al fine di evitare artefatti causati da problemi tecnici come la copertura degli anticorpi sull'intera sezione TMA e problemi di sezionamento. Aggiungere marcatori di orientamento aggiuntivi al modello per l'orientamento. Organizzare i tessuti in base al modello. 2. Manuale di produzione Tissue Microarray (essenziale per le riprese) Per poter ottenere una lunghezza standardizzata dei nuclei di tessuto, segnare il mandrino ad esempio 4,5 mm (Figura 2). Guidelines per la distanza tra i centri di esempio: nucleo dimensioni 0,6 mm – 0,8-1,0 mm nucleo formato da 1,0 mm – 1,8-2,0 mm nucleo formato 1.5 mm – 2,0-3,0 mm nucleo dimensioni 2,0 millimetri – 2,5-4,0 millimetri Si raccomanda di lasciare margini 2,5-3,0 mm su ciascun lato del blocco paraffina per evitare la rottura della paraffina. Montare le punzoni selezionati da utilizzare. Inizia allentando le viti a testa esagonale che tiene il pugno al suo posto. Il punzone è posizionato correttamente quando la scanalatura nel mozzo punzone viene saldamente appoggiato l'asta di metallo in plastica v-blocco. Fissare le viti e fare in modo che il bordo della clip in metallo è orizzontale. Il punzone destinatario (contrassegnati in verde e rosso, specifico per il distributore) deve essere posizionato a sinistra. Il punzone donatore (contrassegnati in verde e blu, specifico per il distributore), che ha un diametro leggermente maggiore, dovrebbe essere collocato a destra (figura 3). Spostare i pugni lungo i x e y assi utilizzando le manopole di regolazione XY. La manopola di regolazione destra sposta i punzoni lungo l'asse x e la manopola di regolazione sinistra sposta i punzoni lungo l'asse y. Vi è una lettura micrometro digitale su entrambe le manopole di regolazione. Questi vengono attivati ​​quando si spostano le manopole. Ripristinare → premere il tasto ZERO / ABS pulsante. Spostamento tra i pollici e mm → premere il tasto IN / mm pulsante. Lo spazio tra i fori devono essere mm 2,0 (misurata tra i centri dei fori) quando si utilizza un punzone 1 mm per un modello 9×8. Per assicurarsi di non spingere il pugno troppo in basso nel blocco, colpendo la cassetta e distruggendo il punzone, mettere una cassetta senza paraffina nel supporto e impostare la posizione di fondo del recipiente punzone a 1 mm sopra il fondo della cassetta utilizzando la vite di arresto di profondità alnell'angolo in alto a sinistra della Z-guida (Figura 3). Mettere il blocco ricevente nel supporto e utilizzare il più piccolo cacciavite per serrare le viti. Non fissare le viti a stretto o la paraffina potrebbero staccarsi dalla cassetta. Premere il punzone ricevente verso il basso di circa 5 mm nel blocco ricevente e utilizzare la maniglia in pugno per ruotare il pugno avanti e indietro una volta (Figura 3). Il buco sarà di 5 mm di profondità quando si spinge il punzone fino giù in blocco il più possibile. Alleviare la pressione verso il basso spingendo lentamente, in modo che le molle può spostare il pugno alto. Utilizzare il mandrino per svuotare il punzone ed eliminare il nucleo di paraffina. Spostare il torretta per passare il punzone donatore (Figura 3). Posizionare il ponte blocco donatore con il blocco donatore sopra il supporto del blocco ricevente (Figura 3). Spingere la puntura donatoreh nella zona selezionata del blocco donatore. Utilizzare un corrispondente ematossilina ed eosina scivolo colorato in cui la regione di interesse è stato contrassegnato per individuare il tessuto che deve essere campionata. Manualmente tenere il blocco dei donatori in posizione con la mano sinistra e spingere il pugno con la mano destra. Si noti che non si dovrebbe spingere il mandrino. L'arresto di profondità non blocca il movimento pugno nella posizione corretta per il blocco dei donatori, quindi è importante che si smette di spingere quando il secondo marchio è visibile sul mandrino. Ruotare la maniglia sul punzone una volta (Figura 3). Rilasciare lentamente la pressione verso il basso tenendo premuto il blocco dei donatori sul ponte blocco donatore. Il tessuto del donatore viene preferibilmente perforato 0,5 millimetri più corto del nucleo destinatario. Questo processo assicurare un allineamento regolabile dei nuclei sulla superficie blocco ricevente, evitando la perdita di tessuto valore rappresentativo. Rimuovere il ponte e il blocco donatore. FareAssicurarsi che il punzone donatore viene allineato con il foro che è stato fatto in precedenza (punto 4). È necessario regolare la posizione di perforazione utilizzando le viti, se il punzone donatore e il foro nel blocco destinatario non sono allineati. Spingere con cautela il pugno verso il basso fino alla sua punta raggiunge la parte superiore del foro nel blocco destinatario. Mantenendo questa posizione, utilizzare il mandrino per svuotare il nucleo tessuto nel foro. La superficie di base deve essere in allineamento con la superficie del blocco. Spostare la parte posteriore della torretta al punzone destinatario. Passare alla posizione successiva, con le manopole di regolazione XY. Ripetere dal 4c precedente punto fino a quando la matrice è completa. Quando il blocco ricevente tutto è finito, allentare le viti del supporto blocco destinatario. Cuocere il blocco in 42 ° C per 40 minuti. Mettere il blocco con l'area di sezionamento rivolta verso il basso su un vetrino. Posizionare il vetrino con il blocco sopra di un supporto provetta (o altra costruzione appropriati) e posto in tha forno. Dopo cottura, togliere il portaprovettoni dal forno e appiattire la superficie del blocco accarezzando delicatamente il vetrino. Posizionare il blocco con il vetrino su una piastra di raffreddamento per 10 minuti. Per garantire tessuto rappresentante tutta la TMA un controllo di qualità su ogni sezione 50 ° viene eseguita. 3. Come TMAs Sezione (Animation 2) Tagliare 4 sezioni micron di spessore utilizzando un microtomo con sistema sezione di trasferimento (HM 355S, Microm). Il sistema può essere utilizzato con tutti microtomi correnti rotanti. Il sistema è costituito da un vettore lama con ponte integrato di trasferimento, un bagno di acqua riscaldata e una unità di controllo. Dalla lama le sezioni scivolare sulla superficie di trasferimento bagnata tramite un ponte di trasferimento in bagno d'acqua. Le sezioni devono essere prelevati da bagno d'acqua subito dopo aver steso, per evitare la fusione dei punti sensibili del tessuto (es. tessuti lipidici ricchi come al seno e al cervello). Place la sezione su un vetrino SuperFrost. Il tempo le sezioni possono essere lasciate in acqua dipende dal tipo di paraffina e cera utilizzata la temperatura dell'acqua. Il nostro laboratorio paraffina uso da HistoLab Products AB, che hanno un punto di fusione di 56-58 ° C e si consiglia una temperatura del bagno d'acqua di 37-39 ° C. Porre i vetrini in un portavetrini per l'essiccazione a temperatura ambiente (RT) per tutta la notte. I vetrini vengono cotti in 50 ° C per 12-24 ore. Utilizzando un microtomo senza STS si devono trasportare la sezione dalla lama di un bagno d'acqua manualmente utilizzando ad esempio un pennello. 4. Test e procedura di titolazione per immunoistochimica (animazione 3) Ciascun anticorpo è stato sottoposto ad una procedura di prova standardizzata utilizzando appositamente progettati TMAs contenenti una miscela di tessuti e tipi di cellule differenti. L'obiettivo è quello di valutare un protocollo immunostaining individuale e ottimizzata per ciascun anticorpo. Inizialmente una diluizione, sulla base formicamagazzino concentrazione ibody dell'anticorpo primario viene testato. Il risultato di questa prova colorazione viene utilizzato per guidare ulteriori diluizioni e ottimizzazione del protocollo. Deparaffinizzazione e idratazione in etanolo xilene e graduale di acqua distillata vengono eseguite prima dell'immunocolorazione. Un passo di blocco per estinguere perossidasi endogena viene eseguita in 0,3% H 2 O 2 in etanolo al 95% per 5 minuti. Indotto dal calore (Recupero di epitopi) viene eseguita in un tampone pH recupero 6, utilizzando una caldaia in pressione (camera Decloaking, Biocare Medical) come fonte di calore per 4 minuti a 125 ° C. Dopo aver completato ebollizione, vetrini rimangono nella caldaia pressione e vengono lasciate raffreddare a 90 ° C. Il tempo di elaborazione totale per HIER è di circa 45 minuti. Se nessun risultato conclusivo è ottenuto nel test iniziale, ulteriori prove sono fatte in base al pattern di colorazione osservata 5 6. Uno studio pilota, nel HPA ad elevata capacità set-up, ha mostratoche il recupero antigene più utile dove HIER pH 6, ma altri metodi di recupero, come pre-incubazione con proteinasi, microonde e punto in tampone con pH maggiore o minore può naturalmente essere utilizzato. Modificando la condizione di IHC ad esempio cambiando i tempi di incubazione di anticorpi, le diluizioni degli anticorpi e diaminobenzidina (DAB) tempi di incubazione del pattern di colorazione può dare risultati più conclusivi. 5. Colorazione Program, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific) Tutte le incubazioni vengono eseguite a temperatura ambiente e questo protocollo può anche essere utilizzato in una configurazione manuale con gli stessi reagenti. Sciacquare in tampone di lavaggio. Incubazione con Ultra V blocco per 5 minuti. Sciacquare in tampone di lavaggio. L'incubazione con anticorpo primario per 30 minuti. Sciacquare in tampone di lavaggio (x2). Incubazione con rafano-perossidasi polimero marcato per 30 minuti. Sciacquare in tampone di lavaggio (x2). Sviluppare in soluzione DABper 10 minuti. Sciacquare in tampone di lavaggio (x2). Controcolorazione in Mayers ematossilina * per 5 minuti. Quando si utilizza un metodo progressivo di colorazione (ad esempio Mayers ematossilina) l'intensità dipende dal tempo e non è necessaria differenziazione. Un metodo di colorazione regressiva esempio ematossilina di Harris richiede differenziazione per rimuovere il colorante in eccesso dai tessuti al fine di accentuare una struttura. Sciacquare con acqua di rubinetto *. Sciacquare con acqua di litio carbonato, diluito 1:5 dalla soluzione satura per 1 minuto *. Sciacquare con acqua di rubinetto per 5 minuti *. Le diapositive sono disidratati in etanolo graded e le diapositive sono coprioggetto (PeRtex, Histolab) Tutti i reagenti sono applicati ad un volume di 300 pl per vetrino. * I passi 10-14 sono fatte in uno strumento histostaining (Autostainer XL, Leica) e coprivetrino è inoltre fatto in un sistema montavetrini (montavetrini Automated CV5030, Leica). 6. Come effettuare la scansioneuna diapositiva Il metodo di scansione di diapositive dipende dal scanner digitale viene utilizzato, questo protocollo definisce solo come eseguire la scansione di una diapositiva con il sistema di scansione automatica Aperio XT (Aperio Technologies). Nella proteina umana Atlas set-up 20x per il tessuto e 40x per le cellule vengono utilizzati. Scansione automatica potrebbe incontrare problemi di fuoco dovuti alla eterogeneità del tessuto e il numero di diversi tessuti inclusi in un TMA. Pulire il vetrino da polvere, colla e verificare la presenza di bolle d'aria tra il vetrino e la sezione. In caso di rimontare bolle d'aria della diapositiva. Mettere il vetrino in un rack e posizionare il cestello nello scanner digitale. Il tempo per la scansione di un TMA a 20x è di circa 6 minuti. Un software di Aperio viene utilizzato per selezionare l'area di interesse. Selezione del punto di messa a fuoco viene effettuata automaticamente all'interno del software. Manualmente la selezione dell'area di scansione e punti di messa a fuoco è inoltre possibile. Dopo che l'immagine hcome stato generato può essere utilizzato per la valutazione e la annotazione della colorazione immunoistochimica. Le immagini rimangono come un file risultato dell'esperimento e può essere distribuito ai colleghi per le discussioni e ulteriormente utilizzati per la pubblicazione dei dati. Le immagini possono essere visualizzate in un software liberamente disponibile da Aperio. 7. Come per cercare il tuo Protein Favorite nell'Atlante proteine ​​umane Sfoglia per www.proteinatlas.org. Immettere il nome del vostro preferito proteine, Ensembl id, numero di accesso UniProt o insulina nome HGNC es. Entrare nella pagina di riepilogo e scorrere verso il basso al tessuto normale e sintesi organo. La panoramica mostra l'espressione della proteina nel pancreas. Clicca su "dati di tessuto più". Si entra nei tessuti normali visualizzare dove si possono vedere tutti i tessuti incluso ordinati per organo. Clicca sul pancreas per visualizzare i risultati IHC per 3 anticorpi diretti verso la stessa proteina. Per visualizzare un high-risoluzione del pancreas click sull'immagine. Ulteriori informazioni espressione della proteina nel tessuto del cancro, le cellule e altri dati di convalida all'interno del Atlas proteina umana può essere trovato navigando Human Protein sito Atlas. 8. Risultati rappresentativi Animazione 1. Come preparare i tessuti per la produzione di tissue microarray. Clicca qui per vedere Animazione 1 . Animation 2. Come TMAs sezione. Clicca qui per vedere Animation 2 . Animazione 3. La tecnica immunoistochimica è descritta. Clicca qui per vedere Animation 3 . Figura 1. Schema generale del processo all'interno della proteina umana Atlas Uppsala. Figura 2. Stiletto donatori segnato per la lunghezza standardizzata di nuclei di tessuto, ad esempio 4,5 mm. Figura 3. Micro-distributore tessuto manuale. Figura 4. Esempi di diversa qualità di TMA prodotte. (A) A diritta e correttamente allineata con TMA spazio sufficiente tra le righe e colonne, nonché al bordo della paraffina. (B) Un TMA con alcuni dei nuclei troppo vicino al bordo conseguente difficoltà probabili Durante il taglio. (C) Un TMA che sono stati cotti per too lunga con un conseguente crollo TMA senza il modello corretto. Figura 5. Ematossilina e eosina TMAs macchiati. (A) una sezione opportunamente tagliato con colonne diritte e allineate e righe. Utilizzando una lama brutto o sporco potrebbe dar luogo alla suddivisione (B) o sezioni compressi (C). Figura 6. Titolazione di anticorpi. (A) Reazione cellule del centro in linfonodo mostra un anticorpo ottimale titolato con un conseguente colorazione citoplasmatica specifica (mostrata in marrone) senza fondo. (B) La sezione di tessuto presenta una debole colorazione. Colorazione negativa o debole si trova quando la concentrazione di anticorpo primario è troppo basso o se la proteina bersaglio non è presente nei tessuti immunocolorate. (C) La sezione di tessuto è overstained dovuto all'uso di concentrazione troppo elevata di anticorpo primario. Il drisultati cromatici arca in difficoltà che determinano la localizzazione subcellulare per traboccare, attraversare reattività e falsa positività.