הפקה של microarrays רקמות, צביעה אימונוהיסטוכימיה ו דיגיטציה בתוך אטלס החלבון האנושי
Summary
Microarrays רקמות מאפשר שיטה יעילה לקבל מידע מקבילים ממספר רב של רקמות. חלקים מייצגים של רקמות נאספו לידי בלוק פרפין אחת. קטעים מתוך בלוק משמשים אימונוהיסטוכימיה וניתוח דפוסי ביטוי חלבון. סריקה דיגיטלית מייצר תמונות המתאימות להפצה של נתונים.
Abstract
רקמת microarray (TMA) הטכנולוגיה מספקת את האמצעים לניתוח תפוקה גבוהה של רקמות תאים רבים. הטכניקה משמשת במסגרת פרוייקט האדם חלבון אטלס לניתוח העולמי הביטוי דפוסי חלבון ברקמות אדם נורמליים, סרטן שורות תאים. כאן אנו מציגים את הרכבה של 1 מ"מ ליבות, לאחזר מרקמות נציג שנבחרו מיקרוסקופית, לתוך בלוק אחד הנמען TMA. מספר וגודל ליבות בבלוק TMA יכולים להיות מגוונים מ כ 40 מ"מ עד 2 ליבות מאות ליבות 0.6 מ"מ. היתרון של שימוש בטכנולוגיה TMA היא כי כמות גדולה של נתונים במהירות יכולה להיות מושגת באמצעות פרוטוקול immunostaining אחת, כדי למנוע השתנות ניסיוני. חשוב לציין, רק כמות מוגבלת של רקמות נדירים יש צורך, המאפשר ניתוח של קבוצות חולים גדולות 1 2. כ 250 קטעים רצופים (4 מיקרומטר עבה) ניתן לחתוך מבלוק TMA ושימשו staini immunohistochemicalng לקבוע דפוסים מסוימים ביטוי החלבון על 250 נוגדנים שונים. בפרויקט האדם חלבון אטלס, נוצרים נוגדנים כלפי כל החלבונים האנושיים נהג לרכוש פרופילים חלבונים המתאימים בשתי רקמות אדם נורמלי מ 144 אנשים ורקמות סרטן מ 216 חולים שונים, המייצגים את 20 הצורות הנפוצות ביותר של סרטן אנושי. מוכתמים Immunohistochemically סעיפים TMA על שקופיות הזכוכית נסרקים ליצור תמונות ברזולוציה גבוהה שממנו פתולוגים יכול לפרש ויסמנו את התוצאה של אימונוהיסטוכימיה. תמונות יחד עם הפתולוגיה מבוססי הנתונים המתאימים הסברים זמינים בפומבי למען הקהילה המחקר באמצעות חלבון אנושי אטלס הפורטל ( www.proteinatlas.org ) (איור 1) 3 4. אטלס החלבון האנושי מספק מפה המראה את הפיזור והשפע היחסי של החלבונים בגוף האדם. גרסה הנוכחישיאון מכיל מעלה מ -11 מיליון תמונות עם הביטוי נתונים חלבון עבור 12.238 חלבונים ייחודיים, המתאימים יותר מ 61% מכלל החלבונים המקודדים על ידי הגנום האנושי.
Protocol
Discussion
אימונוהיסטוכימיה הוא ללא ספק היישום הנפוץ ביותר עבור TMAs. שילוב של IHC ו TMAs ניתן להשתמש במסגרות שונות, כגון סינון תפוקה גבוהה של ביטוי דפוסי חלבון ברקמות 7 8 תאים 9 10 מחקרים, גילוי סמן ביולוגי המבוסס על דגימות רקמה של קבוצות חולים גדולות 11 12 ויותר ביולוגיה הגידול הבסיסי מחקרים, כולל פנוטיפים / גנוטיפים שונים, שלבי התמיינות, התקדמות גרורות 13. אחד היתרונות של שימוש TMAs הוא חומר קבוצות גדולות ניתן לנתח בו זמנית, בשני הניסויים לשחזור יותר חיסכון חומר ביולוגי בעל ערך והבטחת. יתר על כן, השימוש TMA הטכנולוגיה חוסכת בעלויות מגיב ועיבוד הזמן במעבדה. כמו TMA מכיל רק כמות מוגבלת של רקמות, רקמות ההטרוגניות היא הבעיה. בהתאם לסוג של רקמות שאלות כדי לקבל מענה, מספר דוגמאות עשוי להיות נחוץ מן specime אותהn. עבור רקמות סרטן, שימוש של שניים עד ארבעה ליבות כל אחד מן הדגימה מומלץ כפי שהוא הוכח לגרום ברמה גבוהה של דיוק בייצוג של סעיפים רקמות שלמות 13 14. תלוי בהרכב רקמות בקוטר של אגרופים (החל מ 0.6 מ"מ 2) יכול להיות מותאם. רקמות מורכבים מורכב משני סוגי תאים שונים, מבנים שונים מחוץ הסלולר מטריקס. ההרכב של כל סוג רקמה שונה המכיל כמות משתנה של שומן, כלי דם, רקמת חיבור, סחוס וכו ', ישפיע על הלחץ הדרוש אגרופים איסוף ליבות נפרדות. לכן חשוב לתרגל את כל השלבים בהליך על חומר שאינו בעל ערך כלשהו, לפני הפקת TMA עם רקמות שהוגדרו עבור הניסויים המיועדים.
כאשר חתך מגוון של רקמות שונות בתוך בלוק TMA 1 את הרכב הבלוק יכול להשפיע על היכולת לרכוש חלקים באיכות גבוהה. Certain רקמות, כגון עור, מוח עצם, מוח שומן, חזה, לדקלם חתך של גוש TMA קשה בשל השפעת הבדלי מרקם מקרין כמה סעיפים להושיט באמבט מים עד כמה קשיות שונה נחתך על ידי הלהב וכו ' לכן מומלץ לרקמות הקבוצה עם תכונות דומות כגון רקמת השומן עשירה לאחת TMA, כאשר ישים. רוב רקמות סרטן הן במובן זה הומוגנית, המאפשרת חתך של TMAs סרטן. שיטת חתך חלופה לייצוב ליבות microarray יכול להיות מועסק בעת טיפול TMA עם סוגי הטרוגניות של רקמות. השימוש סרט דבק יכול להיות מועיל, כדי למנוע את אובדן ליבות הנשורת ב TMA מחולק. שימוש בסרט הדבקה צריך להיות מועסק בזהירות, שכן הסרט יכול להשפיע על עובי של ליבות מחולקות למדורים ולאחר מכן גם את התוצאה של הכתמה IHC 15. ב חלבון אטלס האדם הגדרת תבנית TMA של 9×8 (לא כולל סמנים) ליבות arדואר בשימוש. יש חשיבות לקבל מספר מקסימלי של חלקים ולשמור את כל הרקמות המיוצגים לאורך הרחוב. כדי לשמור ריאגנטים וזמן הסריקה, סעיפים 2 ממוקמים בשקופית 1 כוס המאפשר תבנית המרבי של 9×8.
מאגר מרכזי עבור מידע חלבון, 16 Universal Resource חלבון כולל כ 20.300 ערכים הנסקרת חלבון אדם, מתוכם רק כ 66% יש ראיות ברמת החלבון. גם ברוב של גנים אשר יש עדויות לקיום ברמת החלבון, יש נדירים, אם בכלל, מידע על תפקוד החלבון והפצה של הביטוי. אתגר חשוב לעתיד היא לנתח את דפוס חלוקת והשפע היחסי של החלבונים האלה מוכרים סוגים שונים של רקמה אנושית. מידע ממסדי נתונים כגון Uniprot, ENSEMBL, הנתונים שפורסמו מתוך PubMed יכול לשמש כמדריך לקבוע אם דפוסי צביעה immunohistochemical באמצעות נוגדניםבמחלקות חלבונים לא ידועים מייצגים פרופילים חלבון בפועל של חלבון המטרה המיועד. בנוסף, מספר אסטרטגיות אימות אחרים נדרשים כדי להבטיח פונקציונליות נוגדנים, עבור פונקציונליות למשל נוגדנים במערכים חלבון, למחוק המערבי, immunofluorescence, חיסוני המשקעים הנפתח ניסויים. אולי הכלי החשוב ביותר עבור אימות של פונקציונליות נוגדנים היא להשתמש נוגדנים לזווג, כלומר שני נוגדנים שונים כנגד העלה נפרדות, שאינן חופפות אפיטופים על חלבון המטרה זהה, להשוות assay ספציפי התוצאה 17.
בהתבסס על מידע מלוקט, נוגדנים נבדקים טיטרציה על פי סטנדרטים IHC ואת החוויה של הבדיקה והאימות של מעל 35.000 נוגדנים הפרויקט האנושי חלבון אטלס. 20% על כל הגנים עם פרופילי חלבון, נתוני נוגדנים לזווג (2 או יותר נוגדנים כלפי שאינן חופפות אפיטופים על אותו חלבון) שימש כדי לקבוע אסתי הטובה ביותרבן הזוג של דפוס חלבון המתאים הביטוי. נוגדנים מותאמים מספקים האסטרטגיה האולטימטיבי עבור אימות אימונוהיסטוכימיה ספציפיות המבוססות על דפוסי ביטוי חלבונים. אסטרטגיה זו חשובה, כי מספר רב של רקמות שונות שנכללו ההקרנה הבסיסית מגביר את הסיכון תגובתיות צולבת. ראוי גם לציין כי רקמות מסוימות באופן כללי נוטים יותר להראות את הרקע מכתים מקרופאגים למשל, שריר חלק, מבנים צינוריים בכליות ו hepatocytes בכבד. נושאים נוספים שיש לקחת בחשבון כוללים וריאציות טכניקות עיבוד רקמות לאורך זמן על הרקמות שנלקחו חומר ארכיוני, אשר עלולה לגרום שווא דפוסים חיוביים שליליים או לא מתאים IHC צביעה. תופעה זו נתקלה גם בניתוח בחלק גדול. בקרות שליליות וחיוביות חיוניים ויש להשתמש בהם בכל הזדמנות אפשרית. עבור מחקרים עמוקים יותר כולל ניתוח פונקציונלי, שורות תאים עם ביטוי מסוים נאלץ ו לדפוק למטה של TR המתאימיםanscripts (טכנולוגיה siRNA) ניתן להשתמש כדי ליצור פקדים. לקבלת תוצאות אופטימליות ב IHC, חשוב לבדוק ולהשתמש אחזור מערכות אנטיגן, שכן קיבוע בפורמלין גורם שינויים כימיים שונים כגון cross-linking, הידרוליזה של בסיסים שיף מסתירה את האנטיגן 18.
לסיכום, נוגדן מבוססי proteomics המעסיקים TMA טכנולוגיה IHC היא אסטרטגיה רב עוצמה ליצירת ביטוי חלבון נתונים בקנה מידה גדול. הפרויקט החלבון האנושי אטלס הוקם כדי ליצור מפה של ביטוי החלבון האנושי ברקמות אדם נורמליים וסרטן. מטרת הפרויקט היא להציג את הטיוטה הראשונה של אטלס חלבון מקיפה האדם בשנת 2015. בנוסף לאספקת פרופילים חלבון איברים ורקמות רגילים, המאמץ הזה גם מספק נקודת המוצא של מחקרים ביו, כולל המאמצים לגילוי סמן ביולוגי קליניים. המטרה הסופית היא להוסיף שכבת המידע הבא על גבי רצף הגנום האנושי Wiתהיה קריטית להבנה עמוקה יותר של הביולוגיה שבבסיס מחלות מדינות שונות, ולספק בסיס לפיתוח כלי אבחון טיפולית חדשנית.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של קנוט אליס ולנברג קרן. צוותי כולו של המרכזים החלבון האנושי אטלס ב אופסלה, שטוקהולם והודו הודה על מאמציהם ליצור אטלס החלבון האנושי. המחברים מבקשים להודות במיוחד פרנק Hammar ואת סופי גוסטפסון לעזרה עם תמונות Elené Karlberg על הסיוע בהפקת TMA כאשר מצלמים.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Wash buffer | Thermo Fisher Scientific | TA-999-TT |
| Citrate buffer pH6 | Thermo Fisher Scientific | TA-250-Pm1X |
| Antibody diluent | Thermo Fisher Scientific | TA-125-UD |
| UltraVision LP HRP polymer | Thermo Fisher Scientific | TL-125-HL |
| DAB plus substrate system | Thermo Fisher Scientific | TA-125-HDX |
| Ultra V Block | Thermo Fisher Scientific | TA-125-UB |
| Primary Antibody Enhancer | Thermo Fisher Scientific | TL-125-PB |
| Mayers hematoxylin | Histolab | 01820 |
| PERTEX | Histolab | 00871.0500 |
| Name of the equipment | Company | Catalogue number |
| Manual tissue micro arrayer | Estigen, Beecher Instrument | MTA-1 |
| Waterfall microtome | Thermo Fisher Scientific | Microm HM 355S |
| Automated image scanner | Aperio Technologies | XT |
| Automated slide staining system | Thermo Fisher Scientific | Autostainer 480S-2D |
| Automated slide staining system for deparafinization and dehydration | Leica Biosystems | Autostainer XL |
| Automated glass coverslipper | Leica Biosystems | CV5030 |
| Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2008INTEL |
Riferimenti
- Battifora, H. The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing. Lab Invest. 55, 244-244 (1986).
- Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat. Med. 4, 844-844 (1998).
- Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies. Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).
- Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).
- Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells. J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).
- Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).
- Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics. Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).
- Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. The Human Protein Atlas – a tool for pathology. J. Pathol. 216, 387-387 (2008).
- Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics. J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).
- Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis. Proteomics. 7, 2142 (2007).
- Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer. Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).
- Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas. Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).
- Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).
- Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources. Cancer J. 7, 24 (2001).
- Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts. Biotech. Histochem. , (2010).
- UniProt. . Nucleic acids research. 39, D214 (2011).
- Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas. Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).
- Leong, A. S., Leong, T. Y. Standardization in immunohistology. Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).
