إنتاج نسيج [ميكروأرس]، وتلطيخ المناعية والتكنولوجيا الرقمية وضمن أطلس البروتين البشري
Summary
ميكروأرس الأنسجة يتيح وسيلة فعالة للحصول على معلومات المتزامنة من عدد وافر من الأنسجة. ويتم تجميع أجزاء من الأنسجة إلى ممثل كتلة البارافين واحد. وتستخدم أجزاء من كتلة لالمناعية وتحليل أنماط التعبير بروتين. المسح الرقمي يولد الصور المقابلة لتوزيع البيانات.
Abstract
نسيج [ميكروأري (TMA) تكنولوجيا يوفر وسيلة لعالية الإنتاجية تحليل للأنسجة وخلايا متعددة. وتستخدم هذه التقنية في إطار مشروع أطلس البروتين الإنسان لتحليل عالمي من أنماط التعبير بروتين طبيعي في الأنسجة البشرية، والسرطان، وخطوط الخلية. هنا نقدم للجمعية من النوى 1 مم، التي تم استردادها من الأنسجة اختيار ممثل مجهريا، في كتلة واحدة المتلقي TMA. يمكن أن تختلف في عدد وحجم النوى في كتلة TMA من ما يقرب من 40 ملم إلى 2 النوى مئات النوى 0.6 مم. وميزة استخدام TMA التكنولوجيا يمكن بسرعة أن كمية كبيرة من البيانات يمكن الحصول عليها باستخدام بروتوكول المناعية واحد لتجنب التقلبات التجريبية. الأهم من ذلك، هناك حاجة إلى كمية محدودة فقط من الأنسجة النادرة، والتي تسمح لتحليل الأفواج المريض كبير 1 2. ويمكن خفض ما يقرب من 250 المقاطع على التوالي (4 ميكرون سميكة) من كتلة والجمعية التونسية للأمهات وتستخدم لstaini المناعىنانوغرام لتحديد أنماط التعبير بروتين معين مقابل 250 الأضداد المختلفة. في المشروع البروتين أطلس الإنسان، تتولد أجسام مضادة تجاه جميع البروتينات البشرية واستخدامها للحصول على البروتين ملامح المناظرة في كل من أنسجة بشرية عادية من 144 أفراد والأنسجة السرطانية من 216 مريضا آخر، وهو ما يمثل 20 الأشكال الأكثر شيوعا من سرطان الإنسان. يتم فحص الملون Immunohistochemically أقسام TMA على شرائح زجاجية لخلق صور عالية الدقة من الذي علم الأمراض يمكن تفسير والتعليق على نتائج المناعية. تصنع الصور جنبا إلى جنب مع البيانات المناظرة الشرح علم الأمراض على أساس المتاحة علنا للمجتمع البحث من خلال بوابة البروتين أطلس الإنسان ( www.proteinatlas.org ) (الشكل 1) 3 4. أطلس البروتين البشري يوفر خريطة تبين توزيع والوفرة النسبية من البروتينات في الجسم البشري. في النسخة الحاليةسيون يحتوي على أكثر من 11 مليون صورة مع البيانات بروتين تعبير عن 12.238 بروتينات فريدة من نوعها، بما يعادل أكثر من 61٪ من جميع البروتينات المشفرة بواسطة الجينوم البشري.
Protocol
Discussion
المناعية هي حتى الآن تطبيق الأكثر شيوعا عن الواجبات الشهرية. ويمكن استخدام مزيج من IHC والواجبات الشهرية في عدة أماكن مختلفة، مثل الإنتاجية العالية لفحص من أنماط التعبير البروتين في أنسجة 7 8 9 10 والخلايا، والدراسات اكتشاف العلامات البيولوجية على أساس عينات الأنسجة من الأفواج المريض كبير 11 12 وأكثر من ذلك بيولوجية الورم الأساسية دراسات، بما في ذلك مختلف الظواهر / المورثات، مراحل التمايز، تقدم والانبثاث 13. واحد الاستفادة من استخدام الواجبات الشهرية هي التي يمكن تحليلها مواد من أفواج كبيرة في وقت واحد، على حد سواء التجارب توفير المواد البيولوجية ذات قيمة، وضمان أكثر استنساخه. وعلاوة على ذلك، واستخدام تكنولوجيا TMA يوفر في تكاليف كاشف والوقت اللازم لتجهيز مختبر. ك TMA يحتوي فقط على كمية محدودة من الأنسجة، وعدم تجانس الأنسجة هي قضية. اعتمادا على نوع من الأنسجة، والمسائل التي ينبغي معالجتها، قد تكون هناك حاجة إلى عدة عينات من نفس specimeن. لأنسجة الورم، وينصح باستخدام 2-4 النوى من كل عينة كما فقد تبين أن يؤدي إلى درجة عالية من الدقة في تمثيل قطاعات النسيج كله 13 14. واعتمادا على تكوين أنسجة تعديلها القطر من اللكمات (التي تتراوح بين 0.6 ملم إلى 2 ملم). أنسجة معقدة وتتكون من كل من أنواع مختلفة من الخلايا عدة والهياكل والمصفوفة خارج الخلوي. تركيبة كل نوع من أنواع الأنسجة المختلفة التي تحتوي على كميات متفاوتة من الدهون، والأوعية الدموية والنسيج الضام، الغضروف وغيرها، تؤثر على الضغط اللازم لاللكم وجمع النوى منفصلة. ولذلك فإنه من الأهمية لممارسة جميع الخطوات في هذا الإجراء على المواد التي ليست له أي قيمة، وذلك قبل إصدار TMA مع الأنسجة المحددة للتجارب المقصود.
عندما باجتزاء مجموعة متنوعة من الأنسجة المختلفة داخل كتلة TMA يمكن للمرء أن تكوين كتلة التأثير على القدرة على الحصول على أجزاء ذات جودة عالية. ميتم قطع الأنسجة rtain، والجلد على سبيل المثال، ونخاع العظام، الدهون، والدماغ والثدي، وتقديم باجتزاء من كتلة TMA صعبا بسبب تأثير الخلافات في نسيج إحداث أقسام كيف نمد في حمام الماء، وكيف صلابة مختلفة من شفرة الخ. ولذلك يوصى للأنسجة مجموعة مع ميزات مشابهة مثل الأنسجة الدهنية الغنية في واحدة TMA، عند الاقتضاء. غالبية أنسجة السرطان هي في هذا المعنى متجانسة، مما يسهل باجتزاء من الواجبات الشهرية السرطان. ويمكن استخدام طريقة بديلة باجتزاء لتحقيق الاستقرار في الصميم عندما ميكروأري التعامل مع الجمعية التونسية للأمهات مع أنواع غير متجانسة من الأنسجة. ويمكن استخدام لاصق يكون من المفيد لتجنب وقوع خسائر من النوى وسقوط خارج في TMA مقطوع. وينبغي استخدام واستخدام شريط لاصق مع الحذر، لأن الشريط يمكن أن تؤثر في سماكة من النوى مقطوع، وأيضا في وقت لاحق نتائج تلطيخ IHC 15. في الأطلس البروتين البشري انشاء قالب TMA من 9×8 (باستثناء علامات) النوى ARاستخدام البريد. فإنه من الأهمية القصوى للحصول على عدد من الأقسام ومنع جميع الأنسجة ممثلة في جميع أنحاء كتلة. لتوفير الكواشف ووقت المسح الضوئي، ويتم وضعها 2 أقسام على شريحة زجاجية 1 السماح لقالب الحد الأقصى ل9×8.
مستودع كبير للحصول على معلومات من البروتين، 16 العالمي من الموارد البروتين ويشمل ما يقرب من 20،300 استعرض مقالات البروتين البشري، منها سوى ما يقرب من 66٪ لديهم أدلة على مستوى البروتين. أيضا للحصول على غالبية الجينات التي توجد أدلة على وجود على مستوى البروتين، وهناك ندرة أو أي معلومات عن وظيفة البروتين وتوزيع التعبير. يشكل تحديا هاما للمستقبل هو تحليل نمط التوزيع، والوفرة النسبية من هذه البروتينات غير معروف في أنواع مختلفة من الأنسجة البشرية. ويمكن استخدام المعلومات من قواعد البيانات مثل Uniprot، ENSEMBL، البيانات المنشورة من مجلات كدليل لتحديد ما اذا أنماط تلطيخ المناعية باستخدام أجسام مضادة لأجنحة البروتينات غير معروف تمثل ملامح البروتين الفعلي للبروتين الهدف المقصود. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى التحقق من صحة عدة استراتيجيات أخرى لضمان وظائف الجسم المضاد، حصول على وظائف الجسم المضاد سبيل المثال في صفائف البروتين، لطخة غربية، المناعي، المناعية هطول الأمطار، وهدم-التجارب. ولعل أهم أداة من أجل التحقق من وظائف الجسم المضاد هو استخدام الأجسام المضادة المقترنة، أي 2 الأجسام المضادة المختلفة التي أثيرت ضد منفصلة الحواتم غير متداخلة، على البروتين الهدف نفسه، لمقارنة الفحص محددة نتيجة 17.
استنادا إلى المعلومات التي تم جمعها، ويتم اختبار الأجسام المضادة ومعاير وفقا للمعايير IHC وتجربة من تجارب والتحقق من صحتها أكثر من 35،000 الأجسام المضادة في المشروع البروتين أطلس الإنسان. لأكثر من 20٪ من جميع الجينات مع لمحات من البروتين، وقد استخدمت بيانات من الأجسام المضادة المقترنة (2 أو أكثر الأجسام المضادة نحو غير متداخلة الحواتم على البروتين نفسه) لتحديد أفضل استيلم نمط البروتين التعبير المطابق. الأجسام المضادة المقترنة توفير استراتيجية في نهاية المطاف للتحقق من صحة محدد بروتين تعبير المناعية المستندة إلى أنماط. هذه الاستراتيجية هي قيمة لأن العديد من الأنسجة المختلفة المدرجة في الفرز الأساسية يزيد من المخاطر بالنسبة للتفاعل المتبادل. وينبغي أن يلاحظ أيضا أن بعض الأنسجة وبشكل عام أكثر عرضة لإظهار خلفية تلطيخ الضامة مثل العضلات الملساء، الأنابيب البعيدة في الكلى والكبد في الكبد. إضافية للنظر في قضايا تشمل اختلافات في تقنيات معالجة الأنسجة مع مرور الوقت للأنسجة مأخوذة من المواد الأرشيفية، والتي يمكن أن تؤدي إلى سلبية أو إيجابية كاذبة غير مناسب أنماط تلطيخ IHC. تم مصادفة أيضا في تحليل هذه الظاهرة قسم كبير. ضوابط السلبية والإيجابية على حد سواء تعتبر حيوية ويجب استخدامها كلما كان ذلك ممكنا. لتعميق الدراسات بما في ذلك تحليلات وظيفية، وخطوط الخلية مع التعبير القسري وهدم محددة-TR من المناظرةويمكن استخدام anscripts (تكنولوجيا سيرنا) لإنشاء الضوابط. لأفضل النتائج في IHC، من المهم لاختبار واستخدام نظم استرجاع مستضد، منذ التثبيت الفورمالين يدفع التعديلات الكيميائية المختلفة على سبيل المثال عبر ربط، التحلل من قواعد شيف اخفاء مستضد 18.
في الختام، الجسم المضاد القائم على البروتيوميات TMA توظيف التكنولوجيا وIHC هي استراتيجية قوية لتوليد البيانات بروتين تعبير على نطاق واسع. تم تعيين الإنسان مشروع أطلس البروتين تصل إلى وضع خريطة للتعبير البروتين البشري في الأنسجة البشرية الطبيعية والسرطان. والهدف من هذا المشروع هو تقديم أول مشروع لأطلس البروتين البشري شامل بحلول عام 2015. بالإضافة إلى تقديم ملامح بروتين طبيعي في الأجهزة والأنسجة، وهذا الجهد كما يوفر نقطة انطلاق لمشاريع البحوث الطبية الحيوية، بما في ذلك جهود السريرية اكتشاف العلامات البيولوجية. والهدف النهائي هو لإضافة طبقة من المعلومات التالية على رأس تسلسل الجينوم البشري أن وايسوف تكون حاسمة لفهم أعمق لعلم الأحياء وراء الحالات المرضية المختلفة، وتوفر أساسا لتطوير أدوات جديدة في التشخيص والعلاج.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة كنوت واليس والنبرغ. واعترف كامل من الموظفين في المراكز البروتين أطلس الإنسان في أوبسالا واستوكهولم والهند لما بذلوه من جهود لإنشاء أطلس البروتين البشري. الكتاب أود أن أشكر خصوصا فرانك الحمار وغوستافسون صوفي للحصول على المساعدة مع الصور وKarlberg Elené للحصول على المساعدة في إنتاج TMA عند تصوير.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Wash buffer | Thermo Fisher Scientific | TA-999-TT |
| Citrate buffer pH6 | Thermo Fisher Scientific | TA-250-Pm1X |
| Antibody diluent | Thermo Fisher Scientific | TA-125-UD |
| UltraVision LP HRP polymer | Thermo Fisher Scientific | TL-125-HL |
| DAB plus substrate system | Thermo Fisher Scientific | TA-125-HDX |
| Ultra V Block | Thermo Fisher Scientific | TA-125-UB |
| Primary Antibody Enhancer | Thermo Fisher Scientific | TL-125-PB |
| Mayers hematoxylin | Histolab | 01820 |
| PERTEX | Histolab | 00871.0500 |
| Name of the equipment | Company | Catalogue number |
| Manual tissue micro arrayer | Estigen, Beecher Instrument | MTA-1 |
| Waterfall microtome | Thermo Fisher Scientific | Microm HM 355S |
| Automated image scanner | Aperio Technologies | XT |
| Automated slide staining system | Thermo Fisher Scientific | Autostainer 480S-2D |
| Automated slide staining system for deparafinization and dehydration | Leica Biosystems | Autostainer XL |
| Automated glass coverslipper | Leica Biosystems | CV5030 |
| Decloaking chamber | Biocare Medical | DC2008INTEL |
Riferimenti
- Battifora, H. The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing. Lab Invest. 55, 244-244 (1986).
- Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat. Med. 4, 844-844 (1998).
- Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies. Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).
- Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).
- Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells. J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).
- Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).
- Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics. Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).
- Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. The Human Protein Atlas – a tool for pathology. J. Pathol. 216, 387-387 (2008).
- Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics. J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).
- Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis. Proteomics. 7, 2142 (2007).
- Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer. Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).
- Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas. Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).
- Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).
- Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources. Cancer J. 7, 24 (2001).
- Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts. Biotech. Histochem. , (2010).
- UniProt. . Nucleic acids research. 39, D214 (2011).
- Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas. Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).
- Leong, A. S., Leong, T. Y. Standardization in immunohistology. Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).
