活体显微镜的脾：寄生虫的流动性和血流量的定量分析
Summary
我们使用GFP转基因疟疾寄生虫和寄生虫的流动性和血流量在本机关的量化脾的活体显微镜的方法。
Abstract
在实验啮齿动物疟疾模型活体显微镜的问世，使寄生虫-宿主相互作用 1,2的知识的重大进展。因此，在预红细胞阶段疟原虫体内成像显示到皮肤淋巴结3，寄生在皮肤4的完整的开发，并形成，以保证移民的一个肝细胞衍生merosome寄生虫的积极入口裂殖子释放进入血液流5。此外，个人寄生虫在红细胞的发展，已最近记录使用4D成像和挑战我们目前蛋白在疟疾6出口。因此，活体成像，从根本上改变我们对疟原虫发展中的关键事件。不幸的是，疟疾寄生虫通过脾，一个主要的淋巴器官的动态通过的研究精美的适应，以清除感染的红Blood细胞缺乏由于技术上的限制。
BALB / C小鼠约氏疟原虫疟疾的小鼠模型，我们已经实施了脾的活体成像和屏障红髓中的成纤维细胞的起源细胞，期间报告的差重塑和坚持寄生的红细胞（pRBCs）与非致命性寄生虫线P.yoelii 17X感染，而不是P.yoelii 17XL致命寄生虫线7感染。为了达到这些结论，一个特定的方法，使用ImageJ免费软件开发，使快速立体单pRBCs运动的特性。获得的结果与本议定书允许速度，方向和居住的寄生虫的时间确定在脾，所有参数，解决在体内坚持。此外，我们报告的血流量，用活体显微镜量化和不同的使用方法着色剂，以获得洞察到复杂的微循环结构的脾ferent。
伦理声明
在巴塞罗那大学动物设施在巴塞罗那CEEA瑞银（协议没有DMAH：5429）大学动物实验伦理委员会批准的准则和协议的规定，所有的动物实验研究。从查尔斯河实验室获得6-8周龄雌性BALB / c小鼠。
Protocol
这种方法是在7日报道，研究使用。 1。动物与绿色荧光蛋白（GFP）转基因寄生虫感染 P.约氏疟原虫 – GFP转基因17XL和17X线使用相同的载体，定位策略和协议描述为 P 伯氏 8。他们表示下普遍存在的P.推动者9 GFP的突变3变 种疟原虫延伸因子1（Pbeef1a），指示组成型表达GFP的寄生虫在红细胞内发育周期的?…
Discussion
脾在这种啮齿动物疟疾模型的活体显微镜的实施开通过这个到现在为止一直被认为是“黑盒子”由于技术方面的考虑机关调查寄生虫的动态通过的可能性。在这里，一个重要的努力，以适应定量的方法，它允许在单一和人口的水平比较分析，不同的寄生虫线。相反，其他组织和细胞已疟疾3,5前成像，成像通过pRBCs通过脾需要考虑到三个维和条块分割的器官，不同的环流存在，快与慢13</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们特别感谢S. Graewe和五Heussler的初始培训和疟疾寄生虫的活体显微镜连续输入，J ·伯恩斯捐赠GFP转基因寄生虫，A.博世（共焦单位，CCIT – UB，IDIBAPS）在图像分析和定量和技术援助，以体育Astola的援助。我们感谢R. Tous的和一视频制作Caralt。 MF是从加泰罗尼亚的一般性的研究生奖学金的收件人。羟基磷灰石是ICREA研究教授。在HAP的实验室的工作是由欧洲共同体的第七框架计划（FP7/2007-2013）根据赠款协议ñ ° 242095的私人基金会左旋（加泰罗尼亚，西班牙），由西班牙科学和创新部（ SAF2009 – 07760）。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
Riferimenti
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites–recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. . The complete spleen. , (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
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Citazione di questo articolo
Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow. J. Vis. Exp. (59), e3609, doi:10.3791/3609 (2012).