Klinik Antikor Örnekleri fagositik Aktivitesi Belirlenmesi

1. Kültür fagositik hücreler Kültür THP-1 10 hücre RPMI 1640 T matara sabit bir süspansiyon olarak% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiştir. FcγR ifade ve test performansı tutarlı düzeyde korumak için hücre yoğunluğu 0.5×10 6 / ml altında tutulmalıdır. 2. Biotinlenmiş Antijen hazırlayın Üreticinin talimatlarına göre faiz hedef antijen biotinylate için gerekli sulfo-NHS LC biotin reaktif kiti miktarını hesaplayın. Biyotinilasyon reaktif su içinde çözülür ve birincil aminler içermez bir tampon hemen antijen için hesaplanan miktar ekleyin. Reaksiyon, ara sıra karıştırarak, oda sıcaklığında 1 saat süreyle devam etmek için izin verin. Küçük kalkan korumak için uygun bir molekül ağırlığı kesme Amicon santrifüj konsantrasyon biriminde tampon döviz fazlalığı, indirekt biotin çıkarınt antijen. Konsantrasyon birimi üst odasına örnek ekleyin ve toplam hacmi 15 ml doldurma çizgisine getirmek için PBS ekleyin. Yaklaşık 1.5 ml hacim getirmek için 4000 xg'de santrifüjleyin. Bu işlemi tekrarlayarak boncuk antijen maksimum kaplama sağlamak için iki kez serbest biotin% 99 kaldıracaktır. 3. Antijen Doymuş Boncuk hazırlayın Iki kere 1, 1 mm floresan neutravidin boncuk 100 ul yıkayın ml% 0.1 PBS-BSA yüksek hızda bir mikrosantrifüj iplik sonra. Yeniden süspanse 10 tüp içine 100 ul PBS-BSA ve kısım boncuk yıkanır. Boncuklar doyurabilecek antijen kaplama koşulları belirlemek için, iki kat adımlar biotinlenmiş antijen konsantrasyonlarında değişen yıkanmış boncuk süspansiyonu ile 10 ul birleştirir. Rotator mikrosantrifüj tüp 4 ° C'de bir gece inkübe edin. NOT: Doygunluk boncuk, deneysel olarak tespit edilmelidir. Bu yapılabilir, boncuk, sonradan kontrol monoklonal antikor ile opsonized zaman maksimum fagositozda verimi boncuk kaplama koşulları belirleyerek. Boncuk pelet kadar yüksek hızda 1 ml PBS-BSA ve santrifüj ile yıkanarak bağlanmamış antijen çıkarın. PBS-BSA kaldırın ve tekrar edin. Son hacim 1 ml PBS-BSA yeniden süspanse antijen kaplı boncuk. Boncuk 4 ° C kullanımdan önce bir hafta kadar saklanır olabilir. 4. Antikor Örnekleri hazırlayın Klinik antikor örnekleri, plazma, üretici talimatlarına göre bir Kavun jel IgG saflaştırma kiti kullanarak arındırılmalıdır. Saflaştırılmış IgG 4 ° C kullanıma hazır olana kadar saklanabilir. NOT: Uygun önlemler işlenmesiyle ilgili insan numunelerinde her zaman alınmış gerekir. A280 absorbans antikorlar arıtılmış konsantrasyonu belirlemek ve örnekleri PBS içinde 1 mg / ml seyreltik. Varsaymak hazırlayın1 mg / ml PBS seyreltme ive ve negatif monoklonal kontrol antikorlar. 5. Deney Kaplama Vorteks yukarıda hazırlanan yıkanmış, antijen doymuş boncuk çözüm süspanse edin ve yuvarlak bir alt 96 plaka her kuyuya 10 ul aktarmak. Bakım, her bir kuyunun eklenir eşit sayıda floresan boncuk sağlamak için sürekli boncuk süspansiyonu ajitasyon alınmalıdır. Her antikor için bir doz-yanıt eğrisi oluşturma, her bir kuyunun ilgi antikorlar konsantrasyonları değişen ekleyin. Optimal konsantrasyonları mevcut antikor titresi bağlı örnekleri arasında farklılık gösterir, ancak 0.01-100 mikrogram / ml final konsantrasyonda bir dizi iyi kapsama sağlamak ve ilgi konsantrasyon aralığı belirlenmesini sağlayacaktır. 20 ul daha geniş hacimli olun antikorları eklenir. 37 2 saat inkübe boncuk ve antikor örnekleri ° C antikorları boncuk opsonize için izin vermek. </ Li> THP-1 hücrelerinin 2.5 x 10 5 hücre / ml süspansiyon hazırlamak, toplam 5 x, her bir kuyunun bu süspansiyon 200 ul 10 4 THP-1 hücreler her iyi. 37 ° gecede ° C'de,% 5 sabit bir inkübatör CO 2, yerçekimi üzerinden pelet izin hücreleri ve boncuk. NOT: Sinyal gürültü optimal boncuk belirlenmesinde tarafından geliştirilmiş olabilir: antikoru: THP-1 hücre oranları belirli bir antijen ve antikor kaynağı için. 6. Akış sitometrik analizi Her hücre pelletini rahatsız etmemek için dikkatli olmak süpernatant 100 ul çıkarın. Sitokin salgılanması tespitler veya diğer analizler istendiğinde supernatant kaydedilebilir. Sabitlenmesi için, her bir kuyu ve pipetlemeyin hücreleri tekrar süspansiyon ve mix 100 ul% 4 paraformaldehid ekleyin. Yüksek verim akım sitometri analizi bir HTS plaka okuyucu ile donatılmış bir BD LSR II kullanılarak yapılabilir. Program yazılımı her iyi üç kez (100 ul karışımın hacmi) karıştırın ve her numunenin 30 ul, ya da en az 2000 hücre olaylar, analiz etmek. FlowJo veya eşdeğer yazılım toplanan veriler analiz edilebilir. Faydalı ölçümlerini boncuk + yüzde floresan hücreler, mevcut fagositik hücrelerin sayısının bir ölçüsüdür sağlar, fagosite boncuk sayısının bir ölçüsüdür sağlar fagositik hücrelerinin yanı sıra floresan içerir. Bu değerlerin çarpılması entegre bir ortalama floresan yoğunluğu, veya iMFI üretir. Her fagositik hücre tarafından fagosite boncuk ortalama sayısı 1 boncuk ortalama floresan iMFI bölünmesi ile hesaplanır. 7. Temsilcisi Sonuçlar Etkilenen ve etkilenmeyen konularda antikor örneklerinin açık bir farklılaşma mevcut olmalıdır. Şekil 1A, HIV negatif bir antikor örnek FACS histogramlartive (siyah eser) ve HIV pozitif (gri iz) konu ve antijen-spesifik antikorların varlığı ile tahrik artan fagositoz göstermektedir. Optimum duyarlılık testinin biotinlenmiş antijen ile boncuk doygunluğu bağlıdır. Şekil 1B farklı miktarlarda antijen ile kaplı boncuklar (bağlayıcı olmayan bir antikor, üçgenler de dahil olmak üzere) 3 kontrol monoklonal antikorlar ile opsonized olduğu gözlenen fagositoz sunar ve bir doyurarak konsantrasyon olarak bu antijeni 2μg antijen / ml boncuk kurar. Bir doz-yanıt eğrisi Şekil 2'de sunulan ve 0,05-5 mg / ml antikor konsantrasyon aralığında fagositoz ikna etmek için tabi antikor örneklerinin diferansiyel kapasitesini gösteriyor. Bu diferansiyel fagositoz titresi veya IgG alt ve glikozilasyon devlet olarak Fc etki alanı özellikleri farklılıklar ya da tahrik olabilir. THP-1 hücreleri i zamanMaged floresan mikroskobu ile, boncuk fagositoz açık bir kanıt yoktur. Şekil 3, antikor opsonized (yeşil) ve non-opsonized (kırmızı) boncuk ile inkübasyon sonra antikor yokluğunda fagositik alımı eksikliği gösteren THP-1 hücreleri hala görüntüleri iki 63x sunar. Zaman atlamalı mikroskopi yapıldığında, floresan boncuk antikor özel fagositik alımı daha da çarpıcıdır (Film 1, 20x büyütme). Önceki iş hücreleri ile ilişkili boncuk içselleştirilmesi onaylamıştır ve birincil monositler ile ilgili deneyler, bu yüksek verim assay (veriler gösterilmemiştir) fagositik puanları (iMFI değerler) ile mutabık kalmışlardır. Şekil 1 Kalite Kontrol Testi. 1A, bir antikor örnek için HIV negatif bir konu (siyah iz) ve HIV pozitif bir konuda (gri iz) fagositoz Flow sitometri histogramlar.1B: Deneysel örnek bir antijen için en uygun boncuk kaplama koşullarının belirlenmesi. Bir kontrol antikor (üçgen) fagositik aktivite gösterir antijen-spesifik monoklonal antikorlar (daire, kare), boncuk antijen / ul> 2 mg ile kaplı boncuk maksimum fagositoz göstermektedir. Şekil 2 Fagositoz doz-yanıt eğrisi. Farklı HIV pozitif (tedavi edilen, işlenmemiş, viral replikasyon kontrolü ve anti-retroviral tedavi yokluğunda sergileyen) ve gp120 HIV negatif konular sürücü fagositoz (HIV zarf) kaplı boncuk Klinik antikor örnekleri. Şekil 3. Verimli İçselleştirme. Mikroskopi, non-opsonized boncuk sol kalırken antikor opsonized boncuk (yeşil) içselleştirilmesi teyitution (63x büyütme). Movie 1, antikor-odaklı fagositoz Time-lapse mikroskopi 14 saat boyunca yüksek verim tayininde kullanılan THP-1 hücrelerinin fagositik aktivite görselleştirme yapılır ve izin verir oldu . Yeşil floresan boncuk antikor opsonized, kırmızı floresan boncuk olumsuz bir kontrol sağlar. film izlemek için buraya tıklayın.