임상 항체 샘플 Phagocytic 활동 결정

1. 문화 Phagocytic 셀 문화 THP – 1 RPMI 1640에서 10 세포는 T의 flasks에 고정 중지 10 % 태아 소 혈청과 보충. 세포 밀도가 FcγR 표현 및 분석 성능을 일관된 수준을 유지하기 위해서는 0.5×10 6 / ML 아래에 유지되어야합니다. 2. Biotinylated 항원을 준비 제조 업체의 지시에 따라 관심의 대상 항원을 biotinylate에 필요한 sulfo – 보건국 LC 비오틴 시약 키트의 양을 계산합니다. 물에 biotinylation 시약을 용해하고 즉시 기본 아민을 포함하지 않는 버퍼에 항원으로 계산된 금액을 추가합니다. 반응이 때때로 혼합, 상온에서 1 시간 동안 진행하실 수 있습니다. targe을 유지하기 위해 적절한 분자량의 컷오프의 Amicon 원심 농도 단위로 버퍼 교환에 의한 초과, unconjugated 비오틴을 제거t의 항원. 농도 단위의 상단 챔버에 샘플을 추가하고 최대 15 ML 채우기 라인에 전체 볼륨을 가지고 PBS를 추가합니다. 약 1.5 MLS에 볼륨을 가지고 4000 XG에 원심 분리기. 이 과정을 반복하면 두 번 구슬로 항원의 최대한의 코팅을 보장하기 위해 무료 비오틴의 99 %를 제거합니다. 3. 항원 포화 비즈 준비 두 번 1 1mm 형광 neutravidin 비즈 100 μl를 씻으 ML 0.1 % PBS – BSA 고속 microcentrifuge 아래로 회전 후. Resuspend 10 튜브에 100 μl PBS – BSA, 그리고 나누어지는의 구슬을 빨기도 했죠. 구슬을 포화 항원 코팅 조건을 확인하려면, 두 배 단계에 biotinylated 항원의 농도 변화로 씻은 비드 정지 10 UL을 결합. 회전에 microcentrifuge 튜브 4 ° C에서 밤새 품어. 참고 : 구슬의 채도가 실험적으로 결정되어야합니다. 이 수행할 수 있습니다구슬은 이후 컨트롤 단클론 항체와 opsonized 때 최대한의 phagocytosis를 얻을 비드 코팅 조건을 식별하여. 구슬이 pelleted 때까지 고속 1 ML PBS – BSA와 원심 분리기로 세척하여 언바운드 항원을 제거합니다. PBS – BSA를 제거하고 반복합니다. PBS – BSA 1 ML의 최종 볼륨 Resuspend 항원 코팅 비즈. 비즈는 4 ° C 이전에 사용시 일주일에 저장할 수 있습니다. 4. 항체 샘플을 준비 임상 항체 샘플 플라즈마는 제조 업체의 지침에 따라 멜론 젤 IgG 정화 키트를 사용하여 정화 수 있습니다. 정화 IgG는 4 ° C 사용을위한 준비까지 저장할 수 있습니다. 참고 : 인간의 샘플을 처리에 대한 적절한 예방 조치는 항상 촬영되어 있어야합니다. A280의 흡광도에 의한 항체를 정화의 농도를 결정하고, PBS 1 MG / ML에 샘플을 희석. 멋부리다 준비1 MG / PBS에서 ML에 희석하여 필자와 부정적인 단클론 항체 제어. 5. 실험을 도금 vortexing에 의해 위에 준비한 씻어, 항원 포화 비드 솔루션을 Resuspend, 그리고 둥근 바닥 96 잘 플레이트의 각 우물에 10 μl를 전송합니다. 관리는 각 잘에 추가됩니다 지속적으로 형광 구슬의 같은 번호를 보장하기 위해 비드 중단을 선동로 이동합니다. 각 항체에 대한 투여 – 반응 곡선을 만들고, 각 잘 관심 항체의 농도 변화에 추가합니다. 최적의 농도는 현재 항체의 titer에 따라 샘플을 사이에 다를 것이지만 0.01-100 μg / ML 최종 농도의 범위는 좋은 혜택을 제공하고 관심의 농도 범위의 신분을하실 수 있습니다. 확인 항체는 20 μl 이하 큰 볼륨에 추가되었습니다. 37에서 2 시간 동안 품어 구슬과 항체 샘플 ° C 항체가 구슬을 opsonize 수 있도록. </ 리> 2.5 × 10 5 세포 / ML에서 THP – 1 세포 현탁액을 준비, 5 X의 총 각 잘이 정지 200 μl를 추가 10 4 THP – 1 각 우물에 세포. 37 밤새 품어 ° C 5 % 고정 인큐베이터에서 CO 2, 중력을 통해 펠렛 수 있도록 세포와 구슬. 참고 : 노이즈에 신호가 최적의 비드를 결정하여 향상시킬 수 있습니다 항체 : THP – 1 주어진 항원과 항체 소스에 대한 세포 비율. 6. 흐름 Cytometric 분석 각각 잘 세포 펠렛을 방해하지 않도록주의되는 뜨는 100 μl를 제거합니다. 시토킨 분비의 결정이나 다른 분석이 필요한 경우에는 뜨는을 저장할 수 있습니다. 고정 들면, 세포를 resuspend과 섞어 각 잘하고 pipet에 4 % paraformaldehyde 100 μl를 추가합니다. 높은 처리량의 흐름 cytometric 분석 HTS 플레이트 리더를 갖춘 BD LSR II를 사용하여 수행할 수 있습니다. 프로그램 소프트웨어를 각각 잘 세 번 (100 μl 믹스 볼륨)를 혼합하고 각 시료 30 μl, 또는 적어도 2,000 셀 이벤트를 분석합니다. 데이터 수집은 FlowJo 또는 이와 동등한 소프트웨어의 분석하실 수 있습니다. 유용한 통계는 비드 +의 퍼센트, 또는 형광 세포, 현재 phagocytic 세포의 수를 측정을 제공뿐만 아니라 phagocytosed 구슬의 수를 측정을 제공하는 phagocytic 세포의 형광 강도를 포함합니다. 이러한 값을 곱한 것은 통합된 의미 형광 강도, 또는 iMFI를 생성합니다. 각 phagocytic 세포에 의해 phagocytosed 구슬의 평균 개수는 1 비드의 평균 형광하여 iMFI를 나누어 계산하실 수 있습니다. 7. 대표 결과 영향 및 영향을받지 과목에서 항체 샘플 명확한 차별이 있어야합니다. 그림 1A는 HIV nega에서 항체 샘플의 FACS histograms를 제공합니다tive (블랙 추적)와 HIV 양성 (회색 추적) 주제하고 항원에 특정한 항체의 존재에 의해 주도 증가 phagocytosis를 보여줍니다. 분석의 최적 감도 biotinylated 항원과 비즈의 채도에 따라 좌우됩니다. 그림 1B는 항원의 다양한 양의 코팅 구슬이 (구속력 항체, 삼각형 등) 3 제어 단클론 항체와 opsonized 때 관찰 phagocytosis을 제시,이 항원에 대한 포화 농도로 2μg 항원 / μl 구슬을 설정합니다. 선량 – 반응 곡선은 그림 2에 제시하고, 0.05-5 μg / ML의 항체 농도 범위 phagocytosis를 유도에 따라 항체 샘플 차등 용량을 보여줍니다. 이 차동 phagocytosis는 titer 또는 IgG의 하위 클래스와 글리코 실화 상태로 FC 도메인 속성의 차이에 의해 구동 수 있습니다. THP – 1 세포가 나는 경우maged은 형광 현미경으로 비드 phagocytosis의 명백한 증거가있다. 그림 3은 항체의 부재에 phagocytic 이해의 부족을 보여주는, 항체 opsonized (녹색) 및 비 opsonized (적색) 구슬과 부화 후에도 THP – 1 세포의 이미지 두 63x를 제공합니다. 시간 경과 현미경을 수행할 때, 형광 구슬의 항체 특정 phagocytic 이해는 (영화 1, 20x 배율) 훨씬 더 강렬합니다. 이전 작품은 세포와 관련된 구슬의 내면화를 확인하고, 기본 monocytes와 실험이 높은 처리량 분석 (데이터가 표시되지 않음)에서 phagocytic 점수 (iMFI 값)과 잘 합의했다. 그림 1. 분석 품질 관리. 1A, HIV 부정적인 주제 (블랙 추적)와 HIV 양성 과목 (회색 추적)에서 항체 샘플에 대한 phagocytosis의 유동세포계측법의 histograms.1B : 샘플 항원에 대한 최적의 비드 코팅 조건의 실험적 결정. 제어 항체 (삼각형)이 더 phagocytic 활동을 보여주는없는 동안 항원 특정 단클론 항체 (원형, 사각형)는,> 2 μg 항원 / 구슬 μl로 코팅 구슬의 최대한의 phagocytosis를 보여줍니다. 그림 2. Phagocytosis 투여량 – 반응 곡선. differentially HIV 양성 (처리, 치료, 및 안티 retroviral 치료의 부재에서 바이러스 복제를 제어할 전시)와 gp120의 HIV 부정적인 과목 드라이브 phagocytosis (HIV 봉투) 코팅 비즈에서 임상 항체 샘플. 그림 3. 효율적인 국제화. 비 opsonized 구슬이 솔에 남아있는 동안 현미경은 항체 – opsonized 비즈 (녹색)의 국제화를 확인ution (63x 배율). 영화 1. 항체 주도 phagocytosis의 시간 경과 현미경은 높은 처리량 분석에 활용 THP – 1 세포의 phagocytic 활동의 시각화 14 시간 코스 이상을 수행하고 있습니다되었습니다. 녹색 형광 구슬이 항체 opsonized 있으며, 빨간색 형광 구슬은 부정적인 컨트롤을 제공합니다. 영화를보고하려면 여기를 클릭하십시오.