XpertのMTB / RIFのテストで肺結核の診断

肺結核が疑われるすべての患者は細菌検査のために少なくとも二つの喀痰検体を提出しなければならないことが結核医療状態の国際規格の標準的な2。痰が最 ​​も高い収率がこの時点で収集された可能な場合には、少なくとも一つの早朝の標本が得られなければならない11 XpertのMTB / RIFアッセイがある誘導または喀出痰から調製された痰のサンプルや濃縮された痰の堆積物に適用することができます正または負の抗酸菌（AFB）塗抹標本は、6、12、13アッセイを持っている結核の臨床上の疑いがある誰のために患者からの検体の使用を意図しています。1、2）抗結核療法を受けていない）<7治療の日、または3）過去60日以内に治療を受けていないていました。それは細菌のDNAは、抗菌薬治療後に持続する可能性があるため、薬物療法7の影響を監視するために使用すべきではないことに注意してください。 <pクラス= "jove_content">などの感染性病原体を送信することができる場合に使用されるカートリッジを含む臨床検体を、扱います。適切なこのような保護使い捨ての手袋を着用などの予防措置、実験室のコートと眼用保護具を使用して、あなたの機関の安全手順とガイドラインに従ってください。 1。喀痰サンプル 注：テストを実行できるGeneXpert DXシステムモジュールがあるので一度だけ多くの標本としてプロセス、！ 対応する検体IDを持つ各XpertのMTB / RIFカートリッジにラベルを付けます。 転送1.0mlを滅菌ピペットを用いて円錐形、スクリューキャップチューブに痰を喀出。また、全体の標本は、元のリークプルーフ痰の収集容器内に処理されることがあります。 滅菌ピペットを用いて喀痰に、2.0ミリリットルXpertのMTB / RIFサンプル試薬（V / V 2:1）を追加します。 蓋を交換し、10秒間激しくチューブを振る-20時間。また、混合物（30秒）ボルテックスすることができます。 チューブを室温で5分間直立することができます。 精力的に10〜20倍管を横に振る。また、渦（30秒）を使用します。 チューブを室温でさらに10分間直立することができます。 標本を検査します。サンプルは痰の目に見える塊で液化する必要があります。 2。濃縮された堆積物 注：テストを実行する可能GeneXpert DXシステムモジュールがあるので一度だけ多くの標本としてプロセス！ 対応する検体IDを持つ各XpertのMTB / RIFカートリッジにラベルを付けます。 滅菌ピペットを用いて円錐形、スクリューキャップチューブに1.5ミリリットルXpertのMTB / RIFサンプル試薬を転送します。 滅菌ピペットを使用したサンプル用試薬を含むチューブに少なくとも0.5ミリリットルの濃堆積物を追加します。 蓋を取り付けて、チューブvを振るigorously 10〜20倍。また、渦（30秒）を使用します。 チューブを室温で5分間直立することができます。 精力的に10〜20倍管を横に振る。また、渦（30秒）を使用します。 チューブを室温でさらに10分間直立することができます。 標本を検査します。サンプルは痰の目に見える塊で液化する必要があります。 3。 XpertのMTB / RIFカートリッジのロード 注：カートリッジにサンプルを追加して30分以内にテストを開始します！ XpertのMTB / RIFカートリッジと検体IDのラベルを確認してください。 カートリッジのふたを開きます。 提供滅菌ピペットを用いて、メニスカスが最小マークの上になるまで、ピペットに液化した試料を吸引し、XpertのMTB / RIFカートリッジの開いているポートにサンプルを転送します。 注：エアロゾル形成のリスクを最小限に抑えるために徐々に分配する！ カートリッジのふたを閉じます。 4。テストを開始 注：テストを開始する前に、GeneXpert DXシステムはGX2.1ソフトウェアが装備されていることを確認し、XpertのMTB / RIFアッセイは、ソフトウェアにインポートされた9に ！ コンピュータの電源をオンにし、GeneXpert Dxの機器の電源をオンにします。 Windowsデスクトップで、GeneXpert Dxのショートカットアイコンをダブルクリックします。 あなたのユーザ名とパスワードを使用してGeneXpert DXシステムソフトウェアにログオンします。 GeneXpert DXシステム]ウィンドウで、 テストを作成]をクリックします。 スキャンカートリッジのバーコードのダイアログボックスが表示されます。 サンプルID]ボックスで 、スキャンまたはサンプルIDを入力します。 XpertのMTB / RIFカートリッジ上のバーコードをスキャンします。 作成テスト]ウィンドウが表示されます。 テストの開始]をクリックします </強い>と表示されるダイアログボックスでパスワードを入力します。 点滅する緑色の光のインストゥルメント·モジュールのドアを開き、カートリッジをロードします。 ドアを閉じます。テストが開始され、光の点滅が停止し、常に緑のままです。テストが終了すると、ランプが消灯します。 システムが実行の終了時にドアロックを解放するまで待機し、モジュールのドアを開け、カートリッジを取り外します。 あなたの機関の標準的な慣行に従って、適切な廃棄容器に使用済みカートリッジを廃棄してください。 5。代表的な結果各XpertのMTB / RIFカートリッジはMTB複雑でRIF耐性の検出と同様に標的細菌の適切な処理のために制御し、PCR反応において阻害剤の存在下（s）を監視するためのサンプル処理制御（SPC）のための試薬が含まれています。プローブ·チェック·コントロール（PCC）は、試薬の再水和に充填PCRチューブを検証カートリッジは、プローブの整合性、および染料の安定性。XpertのMTB / RIFアッセイで9プライマーは81塩基対の"コア"領域を含むrpoB遺伝子の一部を増幅する。分子ビーコンと呼ばれる5つ異なる色の蛍光核酸ハイブリダイゼーションプローブは、全体の81-bpのコアを尋問する14の各分子ビーコンは、標的配列は、野生型rpoBと異なる場合、そのターゲットにバインドしないように特定するように設計されました一塩基置換のように少しずつ順序。彼らが彼らの目標、すなわち、野生型rpoB配列にバインドされている唯一の分子ビーコン蛍光ので、検定の5つの色のいずれかの不在は、関連付けられているコア領域に保存された野生型配列と変異を区別するRIF耐性6。 SPCは、負のサンプルで陽性であるべきであり、正のサンプルで正または負の値となります。テストSPCは、負のテストで検出されない場合、結果は "無効"になります。 PCR反応の開始前に、GeneXpert DXシステムは、ビーズ水分補給、反応管充填、プローブの整合性と染料の安定性を監視するためのプローブからの蛍光シグナルを測定します。プローブからの蛍光シグナルは、割り当てられた受入基準を満たしている場合、PCCを渡します。以下に示すような結果は、測定した蛍光信号と埋め込 ​​まれた計算アルゴリズムからGeneXpert DXシステムによって解釈され、 ビューの結果ウィンドウ9に表示されます。 MTBが検出されました：MTB、標的DNAが検出され、両方のコントロールを、SPCとPCCは、割り当てられた受入基準を満たしています。低いCt値はDNAテンプレートの高い出発濃度を表しています。高いCt値はDNAテンプレートの低濃度を表しています。 MTB検出結果では、 "RIF耐性が検出されました"（ 図1A）、（ "RIF耐性が検出されません。" <strオング>図1B）、または"RIF耐性不定"は別々の行に表示されます。 MTBが検出されない：MTB、標的DNAが検出されていません。両方のコントロール、SPCとPCC、割り当てられた受入基準（ 図2）を満たす。 無効：MTBの有無を決定することはできません：SPCは、受入基準を満たしていない場合、すなわち、サンプルが適切に処理されていないか、またはPCRが阻害された（ 図3）。注：余分な検体を再検査！ エラー：失敗したPCCの結果（FAIL）の1つ以上の。 MTBとSPCの両方は結果が表示されません。注：余分な検体を再検査！ PCCは（PASS）渡された場合は、エラーはシステムコンポーネントの障害によって引き起こされます。 図1：MTB標的DNAが検出され、両方のコントロール、SPCとPCCは、割り当てられた受入基準を満たしています。低いCt値が高いの開始を表すDNAテンプレートの濃度、より高いCt値はDNAテンプレートの低濃度を表しています。 MTB検出結果に"不定RIF抵抗"、 "RIF耐性が検出されない"（ 図1A）、 "RIF耐性が検出されました"（ 図1B）、または別の行に表示されます。 図1A MTB検出されました。RIF耐性が検出されません、rpoB遺伝子の81 bpのRIF耐性決定領域（RRDR）が存在していたのIEのみ野生型核酸配列6。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 図1B MTB検出されました。RIF耐性が検出されました。ポジションをカバーする、プローブB（矢印）のドロップアウトが完了Rの513から517 rpoB遺伝子のRDR。例6は、部分的なシーケンスは、rpoB遺伝子変異D516Vが検出されたことを明らかにした。8は 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 図2 MTBのターゲットDNAが検出されませんでした;両方のコントロールを、SPCとPCCは、割り当てられた受入基準を満たしています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 サンプルが正常に処理されていないため、SPCは、受入基準を満たしていない場合、またはPCRが阻害されているため。MTBの図3に無効な試験の結果、すなわち有無を決定することはできません。3547fig3large.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。