Nós desenvolvemos novas ferramentas de laboratório e protocolos para aquisição de imagens intravital do timo. Nossa técnica deve ajudar na identificação de "nichos" dentro do timo, onde o desenvolvimento de células T ocorre.
Dois fótons-Microscopia (TPM) fornece a aquisição de imagens em áreas mais profundas dentro tecidos e órgãos. Em combinação com o desenvolvimento de ferramentas estereotáxica novo e procedimentos cirúrgicos, TPM se torna uma poderosa técnica para identificar "nichos" dentro de órgãos e ao documento celular "comportamentos" de animais vivos. Enquanto imagem intravital fornece informações que melhor se assemelha ao comportamento real celulares dentro do órgão, é tanto mais trabalhoso e tecnicamente exigentes em termos de equipamentos necessários / procedimentos alternativos que ex aquisição de imagem in vivo. Assim, nós descrevemos um procedimento cirúrgico e da novela titular do órgão "estereotaxia" que nos permite acompanhar os movimentos de Foxp3 + células dentro do timo.
Foxp3 é o regulador mestre para a geração de células T reguladoras (Tregs). Além disso, essas células podem ser classificadas de acordo com sua origem: ou seja. timo diferenciadas Tregs são chamados de "ocorrência natural Tregs" (nTregs), como opposed para perifericamente convertida Tregs (pTregs). Apesar de quantidade significativa de pesquisas tem sido relatado na literatura sobre o fenótipo e fisiologia destas células T, muito pouco se sabe sobre suas interações em vivo com outras células. Esta deficiência pode ser devido à ausência de técnicas que permitissem tais observações. O protocolo descrito neste artigo fornece um remédio para esta situação.
Nosso protocolo consiste na utilização de camundongos nude que falta um timo endógena, uma vez que têm uma mutação pontual na seqüência do DNA que compromete a diferenciação de algumas células epiteliais, incluindo células epiteliais tímicas. Camundongos nude foram gama-irradiados e reconstituídos com abobrinhas óssea (MO) de camundongos GFP / gfp Foxp3-KI. Depois BM recuperação (seis semanas), cada animal recebeu transplante embrionário timo dentro da cápsula renal. Após a aceitação do timo (6 semanas), os animais foram anestesiados, o rim que contém otimo transplantado foi exposto, fixo em nosso titular do órgão, e mantidos sob condições fisiológicas para in vivo de imagens por TPM. Temos vindo a utilizar essa abordagem para estudar a influência de drogas na geração de células T reguladoras.
Neste trabalho, demonstrou os procedimentos para dois fótons de imagem de timócitos dentro de um animal vivo. Nós também descreveu alguns parâmetros que se deve controlar cuidadosamente, como a continuação do fluxo sanguíneo e à manutenção da temperatura do órgão durante os procedimentos de imagem. No entanto, apesar dos esforços o cuidado de manter o órgão estável, artefatos de movimento, como "órgão drifting" pode ocorrer. Correção de imagem posterior pode ser realizado através do desenvolvimento de algoritmos projetados especificamente para esta finalidade. Análise de imagem mais também poderia ser a fonte do desenvolvimento de novos protocolos que visa a minimizar os erros.
O timo é o órgão onde todas as células T são produzidos e, portanto, é o órgão onde imunologistas interessados em compreender a geração de γδ, CD4 ou células T CD8 irá centrar a sua atenção. A maioria dos estudos sobre as células T são baseadas em diferenças de números e / ou estabilidade destas cells após diferentes in vitro / in vivo manipulações. No entanto, somente após a visualização in vivo pudemos observar a interação entre as células do sistema imune envolvidos na manutenção da homeostase 3-7. Portanto, a observação em vivo dos timócitos é provavelmente uma das informações mais importantes em falta para compreender melhor a biologia das células T. Intravital TPM fornece um retrato detalhado dos movimentos de células T e as interações e demonstramos aqui como ele pode ser usado para estudos detalhados de timócito. No entanto, cada técnica tem suas limitações. Embora a aquisição de imagens intravital é o sistema mais acurado para refletir o comportamento de células dentro do corpo, também é verdade que a aquisição da imagem explantado de órgãos é menos trabalhoso e tem sido utilizado para coletar informações importantes sobre o sistema imunológico 8,9. Além disso, não se pode negar métodos de imagem intravital requerem cirurgia para expor os tecidos e vasos sanguíneos em animais anestesiados,que por si só pode causar uma alteração no órgão toda a fisiologia 10. No entanto, existem métodos não-invasiva que abolir a artefatos causados pelo procedimento cirúrgico 11 e novos métodos estão sendo desenvolvidos que melhor se preparar com antecedência os animais a serem utilizados 12. Portanto, novos procedimentos cirúrgicos e portagens irá minimizar ou ignorar as limitações reais de aquisição de imagens intravital e se tornar mais e mais acessível à comunidade científica.
Nós demonstramos que o método que descrevemos é viável e que relata todas as manipulações in vivo sistêmica, a administração dessas drogas, que temos usado. Assim, sugerimos o uso deste método em conjunto com técnicas ex vivo já disponíveis, a fim de complementar e reforçar mais estudos sobre o desenvolvimento timócitos.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer ao Dr. David Olivieri para revisão crítica deste manuscrito, Dr. Nuno Moreno pela ajuda logística para construir o nosso titular animal e almofadas de aquecimento e Dr. Vijay K. Kuchroo para o tipo de doação Foxp3-KI gfp / gfp camundongos. Este trabalho é apoiado pela "Fundação para Ciência e Tecnologia" (FCT, Portugal), conceder # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml |
Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | |
Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | |
20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | |
Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | |
525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | |
595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | |
565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | |
Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | |
Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | |
ImageJ | NIH, USA | ImageJ |