הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית
Summary
פיתחנו במעבדה רומן כלים ופרוטוקולים לרכישת הדמיה intravital של התימוס. הטכניקה שלנו אמור לעזור בזיהוי של "נישות" בתוך התימוס שבו התפתחות תא T מתרחשת.
Abstract
שני הפוטונים מיקרוסקופית (TPM) מספק רכישת התמונה באזורים עמוק בתוך רקמות ואיברים. בשילוב עם פיתוח כלים חדשים stereotactic ניתוחים, TPM הופך טכניקה רבת עוצמה כדי לזהות "נישות" בתוך איברים במסמך הסלולר "התנהגויות" של בעלי חיים. בעוד הדמיה intravital מספק מידע דומה בצורה הטובה ביותר את התנהגות הסלולר אמיתי בתוך איבר, זה גם מייגע יותר תובענית מבחינה טכנית מבחינת ציוד / ההליכים הנדרשים מאשר אלטרנטיבה לרכישת לשעבר הדמיה vivo. לפיכך, אנו מתארים הליך כירורגי הרומן איבר "stereotactic" בעל המאפשרת לנו לעקוב אחר תנועות Foxp3 + תאים בתוך התימוס.
Foxp3 הוא רגולטור עבור הדור של תאים T רגולטוריים (Tregs). יתר על כן, תאים אלה יכולים להיות מסווגים על פי מוצאם: כלומר. התימוס, הבדיל Tregs נקראים "טבעיים המתחוללים Tregs" (nTregs), כמו opposed אל שולי המרה Tregs (pTregs). למרות כמות משמעותית של מחקר דווחה בספרות לגבי הפנוטיפ ופיזיולוגיה של תאים אלה T, מעט מאוד ידוע על יחסי הגומלין שלהם vivo עם תאים אחרים. מחסור זה עשוי להיות בשל העדר של טכניקות שיאפשרו תצפיות כאלה. פרוטוקול המתואר במאמר זה מספק תרופה למצב זה.
פרוטוקול שלנו מורכב באמצעות עכברים בעירום כי חוסר התימוס אנדוגני מכיוון שיש להם מוטציה דייקן ברצף ה-DNA כי הפשרות הבידול של חלק מתאי האפיתל, כולל בתאי אפיתל הרתי. עכברים עירום היו גמא מוקרן ו מחדש עם קישואים העצם (BM) מעכברים Foxp3 KI-GFP / GFP. לאחר התאוששות בע"מ (6 שבועות), כל חיה קיבלה עובריים התימוס השתלת כליה בתוך הקפסולה. לאחר קבלת התימוס (6 שבועות), החיות היו מורדמים, כליות המכיל אתהתימוס המושתל נחשף, קבוע בעל איבר שלנו, וכל הזמן תחת תנאים פיסיולוגיים עבור הדמיה in vivo על ידי TPM. אנחנו משתמשים בגישה זו כדי לחקור את ההשפעה של תרופות הדור של תאים T רגולטוריים.
Protocol
Discussion
במאמר זה הראינו את ההליכים עבור הדמיה של שני הפוטונים thymocytes בתוך החי. אנחנו גם תיאר כמה פרמטרים שצריך לשלוט היטב, כגון המשך זרימת הדם ושמירה על טמפרטורה איבר במהלך ההליכים הדמיה. עם זאת, למרות מאמצי זהיר כדי לשמור על איבר יציב, ההצעה artifacts כגון "האיבר נסחף" יכול להתרחש. תיקון תמונה Posterior יכול להתבצע על ידי פיתוח אלגוריתמים שתוכננו במיוחד למטרה זו. ניתוח התמונה בהמשך יכול להיות גם מקור פיתוח פרוטוקולים חדשים המבקשת למזער טעויות.
התימוס הוא האיבר שבו כל ותאי T מיוצרים, ולכן הוא האיבר שבו אימונולוגים מעוניינים להבין את הדור של γδ, CD4 או CD8 ותאי T ימקדו את תשומת הלב שלהם. רוב המחקרים הנוגעים בתאי T מבוססים על הבדלים במספרים ו / או יציבות של אלה גאמות אחרי שונים במבחנה / ב המניפולציות vivo. עם זאת, רק לאחר להדמיה vivo ב יכולנו לראות את האינטראקציה בין תאים של המערכת החיסונית מעורב בשמירה על הומאוסטזיס 3-7. לכן, בהתבוננות vivo של thymocytes הוא כנראה אחד המידע החסר החשוב ביותר כדי להבין טוב יותר בביולוגיה של התא טי. Intravital TPM מספק תמונה מפורטת של התנועות והאינטראקציות תא T ואנחנו להדגים כאן כיצד ניתן להשתמש בו ללימודים thymocyte מפורט. עם זאת, כל טכניקה יש מגבלות. בעוד intravital הרכישה היא מערכת הדמיה מדויקת ביותר המשקף התנהגות תאים בתוך הגוף, זה גם נכון, כי רכישת תמונה explanted האיברים הוא מייגע פחות נעשה שימוש כדי לאסוף מידע חשוב על המערכת החיסונית 8,9. יתר על כן, אחד לא יכול להכחיש שיטות הדמיה intravital דורשים ניתוח לחשוף רקמות וכלי דם אצל בעלי חיים מרדים,אשר כשלעצמה יכולה לגרום שינוי באיבר כולו הפיזיולוגיה 10. עם זאת, ישנם הלא פולשני שיטות לבטל את החפצים הנגרמת על ידי ההליך הכירורגי 11 ושיטות חדשות מפותחים כי עדיף להכין מראש את בעלי החיים כדי לשמש 12. לפיכך, פעולות כירורגיות חדשים אגרה יהיה למזער או לעקוף מגבלות בפועל של רכישת הדמיה intravital ולהיות יותר ויותר נגיש הקהילה המדעית.
אנחנו הוכיחו כי השיטה שתיארנו אינו ריאלי והוא מדווח כל המניפולציות מערכתית vivo, והתרופות כאלה, השתמשנו. לפיכך, אנו ממליצים על שימוש בשיטה זו, יחד עם טכניקות vivo לשעבר כבר זמין על מנת להשלים ולחזק מחקרים נוספים בדבר התפתחות thymocytes.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד"ר דוד Olivieri לבחינה ביקורתית של כתב היד הזה, ד"ר נונו מורנו על העזרה לוגיסטית לבנות בעל חיים שלנו כריות חימום ד"ר ויג'אי ק Kuchroo על התרומה סוג של Foxp3 KI-GFP / GFP עכברים. עבודה זו נתמכת על ידי "Fundação פסקה Ciência דואר Tecnologia" (FCT, פורטוגל), מענק # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | prepare stock at 20 mg/ml |
| Two-photon microscope | Prairie Technologies Inc. | Prairie Ultima X-Y | |
| Ti:Sapphire laser | Coherent, Inc. | Chameleon Ultra Family | |
| 20x/1.00 NA immersion objective | Olympus Inc. | XLUMPLFLN 20XW | |
| Holder (Filters/Dichroic) | Chroma Technology Corp. | 91018 BX2 (U-MF2) | |
| 525 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET525/50m | |
| 595 nm/50 filter | Chroma Technology Corp. | ET595/50m | |
| 565 nm dichroic | Chroma Technology Corp. | 565dcxr | |
| Imaris software | Bitplane AG Inc. | Imaris | |
| Volocity | PerkinElmer Inc. | Volocity | |
| ImageJ | NIH, USA | ImageJ |
Riferimenti
- Bettelli, E. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature. 441, 235-238 (2006).
- Ramsdell, F., Zúñiga-Pflücker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture. Current protocols in immunology. , (2006).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Miller, M. J. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Hugues, S. Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity. 5, 1235-1242 (2004).
- Tang, Q. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).
- Le Borgne, M. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nature immunology. 10, 823-830 (2009).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).
- Barretto, R. P. J. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17, 223-228 (2011).
