Transretinal تسجيلات ERG من شبكية العين الفأر: ورود Photoresponses المخروط
Summary
ونحن تصف طريقة بسيطة نسبيا من transretinal التسجيلات (ERG) مخطط كهربية الشبكية للحصول على قضيب والمخروط photoresponses من شبكية العين الماوس سليمة. هذا النهج يستفيد من كتلة من انتقال متشابك من المستقبلات الضوئية لعزل ردودهم الخفيفة وتسجيلها باستخدام أقطاب الحقل وضعت في جميع أنحاء شبكية العين المسطحة التي شنت معزولة.
Abstract
هناك فئتين متميزتين من الصور المكونة للخلايا مستقبلة للضوء في شبكية الفقاريات: قضبان ومخاريط. قضبان هي قادرة على الكشف عن الفوتونات واحد للضوء في حين المخاريط بشكل مستمر تحت الظروف المتغيرة بسرعة الضوء الساطع. امتصاص الضوء بواسطة قضيب وأصباغ مخروط محددة البصرية في قطاعات الخارجي من المستقبلات الضوئية يتسبب في سلسلة phototransduction أن يؤدي في النهاية إلى إغلاق قنوات النوكليوتيدات بوابات دوري على غشاء البلازما وفرط الاستقطاب الخلية. ويمكن تسجيل هذا التغيير الناجم عن ضوء في غشاء الحاليين والمحتملين بمثابة photoresponse، إما عن طريق الشفط الكهربائي الكلاسيكية 1،2 تقنيات التسجيل أو عن طريق التسجيلات مخطط كهربية الشبكية transretinal (ERG) من شبكية العين معزولة مع سدت عقاقيري مكونات استجابة بعد المشبكي 3-5. الأسلوب الأخير يسمح للأدوية في متناول طويلة الأمد تسجيلات من المستقبلات الضوئية الماوس ومفيد بشكل خاص للحصول على photoresponses مستقر الابأم المخاريط الماوس نادرة وهشة. في حالة المخاريط، يمكن تنفيذ مثل هذه التجارب على حد سواء في الظروف المظلمة مكيفة والإضاءة المكثفة التالية التي التبييض أساسا جميع الصباغ البصرية، لرصد عملية الانتعاش حساسية مخروط خلال التكيف مع الظلام 6،7. في هذا الفيديو، وسوف نعرض كيفية تنفيذ قضيب وM / L-مخروط يحركها التسجيلات transretinal من الظلام تكييفها شبكية العين الماوس. وسيتم استخدام التسجيلات قضيب من شبكية العين من النوع البري (C57BL / 6) الفئران. عن البساطة، وسوف يتم الحصول على تسجيلات مخروط من transducin قضيب المعدلة وراثيا α وحدة فرعية خروج المغلوب (Tα – / -) الفئران التي تفتقر إلى قضيب يشير الى 8.
Protocol
Discussion
ووصف أسلوب العصا والمخروط يحركها التسجيلات ERG transretinal أعلاه أصبح أداة قوية لتحقيق وظيفة من المستقبلات الضوئية الماوس في كل نوع البرية والحيوانات المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى توصيف سهل من خصائص photoresponse الأساسية، وهذا أسلوب بسيط ويوفر استقرار كبير خلال استجابة طويلة ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من جائزة التطوير المهني من البحوث للوقاية من العمى، والمعاهد الوطنية للصحة منح EY19312 EY19543 (VJK)، وكذلك منح المطلقة من البحوث للوقاية من العمى وEY02687 (قسم طب العيون والعلوم البصرية في جامعة واشنطن).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
| DL-AP-4 | TOCRIS bioscience | 0101 | ||
| All other reagents | Sigma-Aldrich | |||
| Glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | For making electrodes | |
| Filter paper | HARG | Millipore | HABG01300 | |
| Photometer | UDT Instruments | S350 | For light calibration | |
| Radiometric silicon sensor | UDT Instruments | 221 | For light calibration | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | To minimize mechanical noise | |
| Air compressor Panther P 15TC | Werther International | P 15TC | Connected to anti-vibration table | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ9.5 | For mouse eye dissection | |
| Infrared image converters | B.E.Meyers | ProwlerTM | Bound to stereomicroscope | |
| Differential amplifier DP-311 |
Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | 1440A | ||
| Dual Channel 8-pole Filter | KROHN-HITE Corporation | 3382 | ||
| Ceramic resistor | TE Connectivity | CGS SBCHE618RJ | For reheating the perfusion solution | |
| Thermocouple | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Temperature monitor | Omega | DPi32 | Connected to thermocouple | |
| LED 505 nm | TT Electronics/ Optek Technology | Digi-key P/N 365-1185-ND | To apply test flashes/bleaching light | |
| Cautery pen | Bovie | AA25 | For marking the dorsal part of the mouse eyeball | |
| pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices |
Riferimenti
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
- Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
