Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses
Summary
Biz sağlam fare retinadan çubuk ve koni photoresponses elde etmek için transretinal elektroretinogram (ERG) kayıtları nispeten basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım ışığında cevaplar ayırmak ve izole düz monte retina arasında yer alan elektrotlar kullanarak bunları kaydetmek için fotoreseptör gelen sinaptik iletim bloğu yararlanır.
Abstract
Çubuklar ve koniler: gözdeki görüntü oluşturan fotoreseptör iki ayrı sınıfı vardır. Konileri hızla parlak ışık koşullarında değişen altında sürekli faaliyet ise Çubuklar tek ışık fotonları tespit edebiliyoruz. Fotoreseptörlerin dış segmentlerinde çubuk ve koni-spesifik görsel pigmentleri tarafından ışığın emilimi sonunda plazma zarı ve hücre hiperpolarizasyon üzerinde siklik nükleotid kapılı kanallarının kapanmasına yol açan bir fototransdüksiyon basamaklarını tetikler. Mevcut ve potansiyel membran Bu ışık kaynaklı değişim ya klasik emme elektrot kayıt tekniği 1,2 veya farmakolojik olarak bloke postsinaptik yanıt bileşenleri 3-5 ile izole retina gelen transretinal elektroretinogram kayıtları (ERG) tarafından, bir photoresponse olarak tescil edilebilir. İkinci yöntem fare fotoreseptörlerin gelen ilaç-erişilebilir uzun süreli kayıtlar sağlar ve stabil photoresponses fr elde etmek için özellikle yararlı olduğuom kıt ve hassas fare konileri. Koni durumda, bu tür deneyler karanlık adaptasyonu 6,7 sırasında konik fotosensitivite iyileşme sürecini izlemek üzere, her iki esas olarak bütün görsel pigmenti karanlık açıcılar-adapte koşullar ve aşağıdaki yoğun ışık yapılabilir. Bu videoda, biz karanlığa uyumlu fare retinadan çubuk ve M / L-konik tabanlı transretinal kayıtları nasıl gerçekleştirebileceğimizi gösterecektir. Çubuk kayıtlar vahşi tip (C57BL / 6) farelerin retinanın kullanılarak yürütülecektir. 8 sinyal çubuğu yoksun fareler. Basitlik için, koni kayıtları genetiği değiştirilmiş çubuk transdusin gelen α-alt birimi nakavt – (- / Tα) elde edilecektir
Protocol
Discussion
Çubuk ve koni güdümlü transretinal ERG kayıt yöntemi vahşi tipi ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar hem de fare fotoreseptörlerin fonksiyonlarını araştırmak için güçlü bir araç haline gelmektedir yukarıda anlatılan. Temel photoresponse özelliklerinin kolay karakterizasyonu ek olarak, bu basit bir teknik ile yakın-bozulmadan retina preparatlar üzerinde gerçekleştirilen deneyler, uzun süreli sırasında büyük müdahale stabilite sağlar. Vahşi tip farelerde koyu adapte çubuk maksimal tepki…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Körlük Engellenir Research Kariyer Geliştirme Ödülü tarafından desteklenen, NIH hibe EY19312 ve EY19543 (VJK) yanı sıra, Körlük ve EY02687 (Washington Üniversitesi Göz Hastalıkları ve Görsel Bilimleri Bölümü) Engellenir Research tarafından sınırsız ödenekle.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
| DL-AP-4 | TOCRIS bioscience | 0101 | ||
| All other reagents | Sigma-Aldrich | |||
| Glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | For making electrodes | |
| Filter paper | HARG | Millipore | HABG01300 | |
| Photometer | UDT Instruments | S350 | For light calibration | |
| Radiometric silicon sensor | UDT Instruments | 221 | For light calibration | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | To minimize mechanical noise | |
| Air compressor Panther P 15TC | Werther International | P 15TC | Connected to anti-vibration table | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ9.5 | For mouse eye dissection | |
| Infrared image converters | B.E.Meyers | ProwlerTM | Bound to stereomicroscope | |
| Differential amplifier DP-311 |
Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | 1440A | ||
| Dual Channel 8-pole Filter | KROHN-HITE Corporation | 3382 | ||
| Ceramic resistor | TE Connectivity | CGS SBCHE618RJ | For reheating the perfusion solution | |
| Thermocouple | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Temperature monitor | Omega | DPi32 | Connected to thermocouple | |
| LED 505 nm | TT Electronics/ Optek Technology | Digi-key P/N 365-1185-ND | To apply test flashes/bleaching light | |
| Cautery pen | Bovie | AA25 | For marking the dorsal part of the mouse eyeball | |
| pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices |
Riferimenti
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
- Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
