Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses
Summary
We beschrijven een relatief eenvoudige methode van transretinal electroretinogram (ERG) opnamen voor het verkrijgen van staafjes en kegeltjes photoresponses uit intacte muis netvlies. Deze aanpak maakt gebruik van het blok van synaptische transmissie van fotoreceptoren hun lichte reacties te isoleren en hen te registreren met behulp van elektroden veld geplaatst over de geïsoleerde platte gemonteerde netvlies.
Abstract
Er zijn twee verschillende klassen van beeldvormende fotoreceptoren in het netvlies gewervelde: staafjes en kegeltjes. Hengels zijn in staat om enkele fotonen van het licht te detecteren terwijl kegels werken voortdurend onder snel veranderende fel licht. Absorptie van licht door staaf-en kegelvormige specifieke visuele pigmenten in de buitenste segmenten van fotoreceptoren activeert een fototransductie cascade die uiteindelijk leidt tot de sluiting van de cyclische nucleotide-gated kanalen op de plasmamembraan en cel hyperpolarisatie. Dit licht-geïnduceerde verandering in membraan huidige en potentiële kunnen worden geregistreerd als een photoresponse, door een van beide klassieke zuig-elektrode opnametechniek 1,2 of door transretinal electrogram opnamen (ERG) van geïsoleerde netvlies met farmacologisch geblokkeerd postsynaptische respons componenten 3-5. Deze laatste methode maakt het mogelijk drugs-toegankelijke langdurige opnames van de muis fotoreceptoren en is vooral handig voor het verkrijgen van een stabiele photoresponses frOM de schaarse en kwetsbare muis kegels. In het geval van kegels, kunnen dergelijke experimenten worden uitgevoerd, zowel in donker aangepaste voorwaarden en volgende intense verlichting die in wezen bleekt alle visuele pigment, om het proces van kegel fotosensibiliteit herstel te volgen tijdens de donkere aanpassing 6,7. In deze video laten we zien hoe de staaf-en M / L-cone-driven transretinal opnames van donker aangepaste muis netvlies uit te voeren. Stang opnamen worden uitgevoerd met netvlies van wild type (C57BL / 6) muizen. Voor de eenvoud zal conus opnames worden verkregen uit genetisch gemodificeerde staaf transducin α-subunit knockout (Tα – / -) muizen die stang missen signalering 8.
Protocol
Discussion
De methode van staaf-en kegelvormige gedreven transretinal ERG opnames hierboven beschreven wordt een krachtig instrument voor het onderzoeken van de functie van de muis fotoreceptoren in zowel wild-type en genetisch gemodificeerde dieren. Naast de gemakkelijke karakterisering van elementaire photoresponse eigenschappen deze eenvoudige techniek biedt grote respons stabiliteit tijdens langdurige experimenten uitgevoerd op nagenoeg in intacte retina preparaten. Zowel donker aangepaste hengel maximale respons amplitude en …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door Career Development Award van Onderzoek om blindheid te voorkomen, NIH subsidies EY19312 en EY19543 (VJK), maar ook door onbeperkte subsidie van Onderzoek om Blindheid en EY02687 (Afdeling Oogheelkunde en Visual Sciences aan de Universiteit van Washington) te voorkomen.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
| DL-AP-4 | TOCRIS bioscience | 0101 | ||
| All other reagents | Sigma-Aldrich | |||
| Glass capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | For making electrodes | |
| Filter paper | HARG | Millipore | HABG01300 | |
| Photometer | UDT Instruments | S350 | For light calibration | |
| Radiometric silicon sensor | UDT Instruments | 221 | For light calibration | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | To minimize mechanical noise | |
| Air compressor Panther P 15TC | Werther International | P 15TC | Connected to anti-vibration table | |
| Stereomicroscope | LEICA | MZ9.5 | For mouse eye dissection | |
| Infrared image converters | B.E.Meyers | ProwlerTM | Bound to stereomicroscope | |
| Differential amplifier DP-311 |
Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | 1440A | ||
| Dual Channel 8-pole Filter | KROHN-HITE Corporation | 3382 | ||
| Ceramic resistor | TE Connectivity | CGS SBCHE618RJ | For reheating the perfusion solution | |
| Thermocouple | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Temperature monitor | Omega | DPi32 | Connected to thermocouple | |
| LED 505 nm | TT Electronics/ Optek Technology | Digi-key P/N 365-1185-ND | To apply test flashes/bleaching light | |
| Cautery pen | Bovie | AA25 | For marking the dorsal part of the mouse eyeball | |
| pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices |
Riferimenti
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
- Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
- Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
- Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
- Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
- Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
- Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
- Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
- Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
- Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).
