Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma
Summary
Rift Vadisi ateşi virüs MP-12 aşı suşu için ters genetik sistemi ek MP-12 mutantlar artan zayıflama ve immünojenite oluşturmak için yararlı bir araçtır. Biz NSS mutant suşlar oluşturmak ve karakterize etmek için protokol açıklar.
Abstract
Hemorajik ateş, nörolojik bozukluklar veya insanlarda körlüğe ve yüksek oranda kürtaj ve geviş getiren hayvanların 1 fetal malformasyon neden Rift Vadisi ateşi virüsü (RVFV), bir HHS / USDA seçin ajan ve 3 patojen bir risk grubu örtüşüyor olarak sınıflandırılmıştır. Bu, aile Bunyaviridae cinsi Phlebovirus ait ve bu ailenin en şiddetli üyelerinden biridir . 2006 yılından bu yana RVFV MP-12 aşı suşu 2,3 ZH548 ve ZH501 dahil olmak üzere yabani tip RVFV suşları 4-6, yanı sıra pek çok ters genetik sistemler geliştirilmiştir . MP-12 suşu (risk grubunda 2 patojen ve non-select ajan olan) birkaç kendi mutasyonlar M ve L-segmentleri oldukça zayıflatılmış, ancak hala fonksiyonel bir virülans kodlar öldürücü G-segment RNA 3 taşır faktörü, NSS. Effic çoğaltır rMP12 C13type (C13type) NSS ORF silme-kare% 69 taşıma, bilinen tüm NSS fonksiyonları yoksunient VeroE6 hücrelerinde MP-12 tip I IFN eksik yok. NSS, interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 dahil olmak üzere, ev sahibi transkripsiyon kapatma indükler ve post-translasyon seviyesinde çift sarmallı RNA-bağımlı protein kinaz (PKR) bozulması teşvik 9,10 IFN-beta transkripsiyonel IFN-alfa interferon düzenleyici faktör 3 (IRF-3), NF-kB ve aktivatör protein-1 (AP-1), IFN-beta ve IFN-alpha/beta reseptör bağlayıcı (IFNAR) upregüle transkripsiyonu uyarır NSS IFN-beta gen dahil olmak üzere ana transkripsiyon bastırma viral replikasyon yanıt, bu ISGs gen upregulations engeller ise, ev sahibi antiviral aktivite gösteren genler veya diğer interferon uyarılan genlerin (ISGs) 11, rağmen IRF-3, NF-kB ve aktivatör protein-1 (AP-1) RVFV7 tarafından aktif hale getirilebilir. . Böylece, NSS, daha da azaltmak için MP-12 ve IFN-beta bastırma fonksiyonu kaldırılarak, doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını barındıran geliştirmek için mükemmel bir hedef. Burada, Rekombinant bir MP-12 kodlaması mutasyona uğramış NSS üretmek için bir protokol tanımlayan ve IFN-beta mRNA sentezini bastırmak için fonksiyonu olmayan NSS mutantlar tanımlamak için bir tarama yöntemi bir örnek oluşturmaktadır. Doğuştan gelen bağışıklık önemli rol ek olarak, tip I IFN, dendritik hücreler ve adaptif immün yanıt 12-14 indüksiyon olgunlaşması için çok önemlidir . Böylece, NSS mutantlar tip I IFN inducing daha da zayıflatılmış, ama aynı zamanda onları aşılama yaklaşımlar için ideal bir aday yapar yabani tip MP-12, daha teşvik edici bir konak bağışıklık yanıtlarını daha verimlidir.
Protocol
Discussion
RVFV için genetik sistemleri Ters T7 organizatörü 2,4,5 veya 3 fare veya insan 4 pol-I organizatörü kullanılarak çeşitli gruplar tarafından geliştirilmiştir. Bu yazıda, rekombinant RVFV MP-12 suşları, 15 stabil bir şekilde ifade T7 RNA polimeraz BHK/T7-9 hücreleri kullanarak oluşturmak için bir protokol açıklar. BHK/T7-9 hücrelerin durumuna göre farklılıklar viral geri kazanım verimliliği, plazmid miktarı, transfekte hücreleri ve benzeri numarası. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Hibe sayısı 5 Mükemmellik Batı Bölge Merkezi (WRCE) yoluyla U54 AI057156-07, 1 R01 AI08764301-A1 Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Üniversitesi'nde bir iç finansman Sealy Aşı Geliştirme Merkezi tarafından finanse edildi Texas Medical Branch.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | InvivoGen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
Riferimenti
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
