Electroporation من اللحمة المتوسطة الجمجمة
Summary
غضاريف تطوير القحفي على اتصال وثيق مع أنسجة أخرى ، ويصعب التلاعب في الحيوانات الحية. نحن نستخدم electroporation لتقديم الأدوات الجزيئية أثناء نمو الهيكل العظمي القحفي مع تجاوز آثار الجنينية المبكرة. وسوف تسمح لنا هذه المقاربة لاختبار كفاءة المرشح جزيئات<em> في الجسم الحي.</em
Abstract
Electroporation وسيلة فعالة لإيصال الحمض النووي وغيرها من الجزيئات المشحونة في الأنسجة عند نقاط زمنية محددة وفي أماكن محددة. على سبيل المثال ، تم استخدام electroporation مع النجاح الكبير لدراسة التنمية العصبية وشبكية العين في القيطم والدجاج والفأر 1-10. ومع ذلك ، فمن المهم أن نلاحظ أنه في كل هذه الدراسات والمحققين لا تستهدف الأنسجة الناعمة. لأن نحن مهتمون في التنمية القحفي ، وتكييفها لدينا طريقة لاستهداف اللحمة المتوسطة في الوجه.
وجدنا أننا عندما بحثت في الأدب ، لدهشتنا ، وتقارير عدد قليل جدا من نقل الجينات في الأنسجة الغضروفية ناجحة. وكانت غالبية هذه الدراسات دراسات العلاج الجيني ، مثل تسليم سيرنا أو البروتين إلى خطوط الخلية مكون للغضروف ، أو النماذج الحيوانية من التهاب المفاصل 11-13. في الأنظمة الأخرى ، مثل الدجاج أو الماوس ، وقد electroporation اللحمة المتوسطة من الوجه تحدي (communicat الشخصيةالأيونات ، دائرة التنمية الجمجمة ، بوكل). افترضنا أن electroporation في الأنسجة الغضروفية وprocartilaginous في القيطم قد يعمل على نحو أفضل. في دراساتنا ، وتبين لنا أن نقل الجينات في غضاريف الوجه يحدث بكفاءة في المراحل المبكرة (28) ، وعندما تتكون يزال منشم الوجه الأنسجة اللينة قبل التمايز الغضروف.
القيطم هو نظام للوصول للغاية لتحليل الفقاريات التنمية القحفي. هياكل القحفي بسهولة أكثر وضوحا في القيطم مما كانت عليه في أي نموذج الفقاريات الأخرى ، في المقام الأول لأن الأجنة المخصبة القيطم خارجيا ، مما يسمح للتحليل في المراحل المبكرة ، وتسهيل التصوير العيش في قرار خلية واحدة ، فضلا عن إعادة استخدام الأمهات 14. بين النماذج الفقاريات النامية خارجيا ، القيطم هو أكثر فائدة للتحليل القحفي من الزرد ، والقيطم اليرقات تكون أكبر وأسهل في ديssect ، ومنطقة نامية الوجه هو أكثر يسرا لتصوير ما يعادل أكثر من منطقة في الأسماك. بالإضافة إلى ذلك ، القيطم تطويريا هو أقرب للإنسان من الزرد (~ 100 مليون سنة أوثق) 15. أخيرا ، في هذه المراحل ، الشراغف القيطم تتسم بالشفافية ، والتعبير المتزامنة من البروتينات الفلورية أو الجزيئات سيسمح التصور السهل للغضاريف النامية. ونحن نتوقع أن هذا النهج سوف تسمح لنا بسرعة وكفاءة اختبار الجزيئات مرشح في النظام النموذجي في الجسم الحي.
Protocol
Discussion
في هذا الفيديو ، وقد أثبتنا جدوى إيصال الجينات electroporation بوساطة اللحمة المتوسطة في الوجه من الشراغف الضفدع. باستخدام هذا النهج ، يمكننا تجاوز الآثار التنموية في وقت مبكر من التلاعب وظيفة الجين مما يسمح لنا استهداف الأنسجة عند نقاط محددة وقت لاحق. دراستنا تظهر أن يمكن أن يتأثر السكان غير متجانس من خلايا اللحمة المتوسطة القحفي ، مما يسمح لنا لدراسة نسب الخلايا electroporated فضلا عن متطلبات الحكم الذاتي للبروتينات الخلية في المصالح. تعيش جنبا إلى جنب مع التصوير ، يمكننا استخدام هذا النهج لدراسة وظائف الجينات ، بمرور الوقت ، أثناء تطوير القحفي. هذا الأسلوب الرواية الضوء على قابلية الإستطراق من القيطم لدراسة organogenesis. ونحن نتوقع أن هذا الأسلوب يمكن تكييفها على نطاق واسع لدراسة التشكل وتمايز الأنسجة الأخرى كذلك.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لPapalopulu نانسي وBoyan بونيف للحصول على المساعدة مع electroporation القيطم. كما نشكر مارك ديون لقراءة نقدية ، وجون جرين جيريمي الينجفورد للمناقشات مفيدة وأفراد المختبر ليو لدعمهم. وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من BBSRC (BB/E013872/1) ويلكوم ترست (081880/Z/06/Z) لKJL.
Riferimenti
- Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).
- Haas, K. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Calegari, F. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
- Drinjakovic, J. E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN. Neuron. 65, 341-357 (2010).
- Falk, J. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC. Dev. Biol. 7, 107-107 (2007).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain. J. Vis. Exp. (17), e705-e705 (2008).
- Kuriyama, S. Tsukushi controls ectodermal patterning and neural crest specification in Xenopus by direct regulation. of BMP4 and X-delta-1 activity. Development. 133, 75-88 (2006).
- Mende, M., Christophorou, N. A., Streit, A. Specific and effective gene knock-down in early chick embryos using morpholinos but not pRFPRNAi vectors. Mech. Dev. 125, 947-962 (2008).
- Neumann, E. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. Embo. J. 1, 841-845 (1982).
- Price, S. R. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109, 205-216 (2002).
- Grossin, L. Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation. Faseb. J. 17, 829-835 (2003).
- Khoury, M. A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis. J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).
- Takahashi, D. Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits. Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Wheeler, G. N., Brandli, A. W. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus. Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).
