Electroporation של Mesenchyme Craniofacial
Summary
הסחוסים Craniofacial לפתח בקשר הדוק עם רקמות אחרות וקשה לתפעל חיות לחיות. אנחנו משתמשים electroporation לספק כלים מולקולריים במהלך הצמיחה של השלד craniofacial תוך עקיפת תופעות העוברית המוקדמת. גישה זו תאפשר לנו לבחון ביעילות מולקולות מועמד<em> In vivo.</em
Abstract
Electroporation היא שיטה יעילה של אספקת DNA ו מקרומולקולות טעונים אחרים לרקמות בנקודות זמן מדויק במקומות מדויקים. לדוגמה, electroporation שימש בהצלחה רבה ללמוד ההתפתחות העצבית ואת רשתית ב Xenopus, עוף עכבר 1-10. עם זאת, חשוב לציין כי כל המחקרים הללו, החוקרים לא היו המיקוד הרקמות הרכות. כי אנו מעוניינים בפיתוח craniofacial, התאמנו שיטה למקד mesenchyme הפנים.
כאשר חיפשנו את הספרות, גילינו, להפתעתנו, דיווחים מעטים מאוד מוצלח של העברת גנים לתוך רקמת סחוס. רוב המחקרים הללו היו מחקרים ריפוי גנטי, כגון משלוח siRNA או החלבון לתוך שורות תאים chondrogenic, או במודלים של בעלי חיים של דלקת פרקים 11-13. במערכות אחרות, כגון עוף או עכבר, electroporation של mesenchyme הפנים כבר מאתגר (communicat אישייונים, מחלקת פיתוח Craniofacial, KCl). החוקרים שיערו כי electroporation לרקמות procartilaginous ו סחוסי ב Xenopus יכול לעבוד טוב יותר. במחקרים שלנו, אנו מראים כי העברת גנים לתוך סחוסים הפנים מתרחשת ביעילות בשלבים מוקדמים (28), כאשר primordium הפנים מורכבת עדיין של רקמות רכות לפני בידול הסחוס.
Xenopus היא מערכת החולייתנים נגיש מאוד לניתוח של פיתוח craniofacial. מבנים Craniofacial הם בקלות רבה יותר גלוי Xenopus מאשר כל מודל חוליות אחרים, בעיקר משום עוברי Xenopus הן מופרות באופן חיצוני, דבר המאפשר ניתוח בשלבים המוקדמים, והקלה על הדמיה ברזולוציה לחיות תא בודד, כמו גם שימוש חוזר של 14 אמהות. בין הדגמים חוליות פיתוח חיצונית, Xenopus שימושית יותר לניתוח craniofacial מאשר דג הזברה, כמו זחלים Xenopus הם גדולים יותר, קל יותר dissect, ובאזור הפנים פיתוח נגיש יותר מאשר באזור הדמיה המקבילה דגים. בנוסף, Xenopus היא אבולוציונית קרוב יותר לבני אדם מאשר דג הזברה (~ 100 מיליון שנה קרובה) 15. לבסוף, בשלבים אלה, ראשנים Xenopus הם שקופים, והביטוי מקביל של חלבונים או מולקולות ניאון תאפשר ראיה קל של הסחוסים מתפתחות. אנו צופים כי גישה זו תאפשר לנו במהירות וביעילות מבחן מולקולות מועמד במערכת מודל vivo.
Protocol
Discussion
בסרטון הזה, אנחנו הדגימו את ההיתכנות של משלוח electroporation בתיווך גנים לתוך mesenchyme הפנים של Xenopus ראשנים. בגישה זו, אנו יכולים לעקוף את השפעות ההתפתחות המוקדמים של מניפולציה תפקוד הגן מאפשר לנו למקד רקמות ספציפיות בנקודות זמן מאוחר יותר. המחקרים שלנו מראים כי באוכלוסיות הטרוגנית של תאים mesenchymal craniofacial יכול להיות מושפע, מאפשר לנו לבחון את שושלת היוחסין של תאים electroporated כמו גם דרישות אוטונומי התא חלבונים של עניין. בשילוב עם הדמיה לחיות, אנחנו יכולים להשתמש בגישה זו כדי לחקור תפקוד גנים, במשך הזמן, במהלך ההתפתחות craniofacial. שיטה זו מדגישה את הרומן נהילות של Xenopus לחקר organogenesis. אנו צופים כי בשיטה זו ניתן להתאים באופן כללי ללמוד המורפוגנזה והבחנה של רקמות אחרות.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ננסי Papalopulu ואת בויאן Bonev לסיוע עם electroporation Xenopus. אנו מודים גם מארק את דיון על קריאה ביקורתית, ג'רמי גרין וג'ון שוולינגפורד לדיונים וחברי מועיל של המעבדה ליו על תמיכתם. עבודה זו מומנה על ידי תרומות של BBSRC (BB/E013872/1) ואת האמון Wellcome (081880/Z/06/Z) כדי KJL.
Riferimenti
- Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).
- Haas, K. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
- Calegari, F. Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture. Differentiation. 72, 92-102 (2004).
- Drinjakovic, J. E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN. Neuron. 65, 341-357 (2010).
- Falk, J. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC. Dev. Biol. 7, 107-107 (2007).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain. J. Vis. Exp. (17), e705-e705 (2008).
- Kuriyama, S. Tsukushi controls ectodermal patterning and neural crest specification in Xenopus by direct regulation. of BMP4 and X-delta-1 activity. Development. 133, 75-88 (2006).
- Mende, M., Christophorou, N. A., Streit, A. Specific and effective gene knock-down in early chick embryos using morpholinos but not pRFPRNAi vectors. Mech. Dev. 125, 947-962 (2008).
- Neumann, E. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. Embo. J. 1, 841-845 (1982).
- Price, S. R. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109, 205-216 (2002).
- Grossin, L. Direct gene transfer into rat articular cartilage by in vivo electroporation. Faseb. J. 17, 829-835 (2003).
- Khoury, M. A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis. J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).
- Takahashi, D. Down-regulation of cathepsin K in synovium leads to progression of osteoarthritis in rabbits. Arthritis. Rheum. 60, 2372-2380 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Wheeler, G. N., Brandli, A. W. Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus. Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).
