Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

1. Klonlama inşa hedef gene/ABDz1-tagged füzyon Ifade plazmid hedef gen (plazmid içeren ABDz1 bir malzeme transferi anlaşması üzerinden serbestçe kullanılabilir) N-terminal ligasyonu için uygun kısıtlama siteleri tarafından çevrili ABDz1 geninin PCR parçaları hazırlayın. Cleave saflaştırılmış ifade vektör ve uygun bir reaksiyon tamponu seçilen restriksiyon enzimleri ile PCR parçaları. Ligasyonu önce ürünleri arındırın. , Ilgi gen içeren ekspresyon vektörü sınırlı ABDz1 parçası bağlanır ve E. ligasyonu ürün dönüşümü coli (orijinal yöntem RR1ΔM15 zorlanma 8 kullanılmıştır). Seçim için uygun antibiyotikler ile takviye agar plaklarına dönüştürülmüş hücreleri yayılmıştır. PCR ekran birkaç koloni ve sıra DNA dizi analizi ile ortaya çıkan ifade kaset doğrulayın. Bir gecede bir dizi verif kültürü plazmid hazırlayınIED koloni ve tercih edilen bir ifade suşu (Rosetta insan genleri tarafından kodlanan proteinlerin üretimini artırmak için plazmid bir pRARE barındıran özgün yöntemi E. coli (de3) kullanılmıştır) dönüşüm . 2. Protein ekspresyonu Tek bir bakteri kolonisi, 5 g / l maya özü ve uygun antibiyotik ile desteklenmiş triptik soy broth 10 ml inoküle edin. ° C gecede 37 150 rpm'de inkübe edin. 1 ml, 100 ml taze orta gecede kültür aşılamak ve hücrelerin logaritmik büyüme fazı ulaştığınızda protein ekspresyonu (lac operonunun kullanılan izopropil-β-D-thiogalactoside başlangıçta 1 mM) neden. 150 rpm'de 25 ° C gecelik ve hasat hücreler santrifüj tarafından inkübe edin. 3. Ortogonal yakınlık arıtma 25 ml çalıştıran tamponu (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 0.05 (w / v) Tween 20, pH 8.0) pelletini tekrar ve th bozabilir% 60 genlik ve 3 dakika 1.0/1.0 bakliyat sonication e hücreleri. Örnek Santrifüj ve supernatant (0,45 mikron) ve daha ileri saflaştırma önce hedef protein içeren filtre. 1 ml / dak 'da uygun bir protein arıtma sistemi tampon çalışan 10 sütun hacimleri (CV) ile tedarikçi tavsiyelerine göre daha önce HSA ile birleştiğinde ya da 1 ml HSA sepharose kolon veya NHS aktif sütun, muvazene. 0.5 ml / dak bakteriyel lizat yükleyin ve sonra akış hızı 1 ml / dak sıfırlanır. 5 yıkama tampon CV (5 mM NH 4 Ac, pH 5.5) takip çalışan tampon CV ile 5 sütun yıkayın. 1 ml / dak elüsyon tamponunda (0.5 M HAC, pH 2.5) ile örnek Zehir ve daha ileri saflaştırma için yıkandı, zirveden kesirler seçmek için 280 nm, monitör emme kesirleri toplamak. Yüksek protein konsantrasyonu Havuz kesirler, Sure çalışan tampon iki kez seyreltilmiş (20 mM fosfat, 150 mM NaCl, pH 7.2) vepH yaklaşık nötr olduğundan emin olun. Gerekirse pH artırmak için 1 M Tris-HCl, pH 8 ekleyin. 0.5 ml / dk, 1 ml / dak Sure çalışan bir tampon 10 CV ile dengelenmiş bir 1 ml HiTrap MabSelect Sure sütun örnek yükleyin. Yükledikten sonra 1 ml / dak akış hızı sıfırlayın. Tabii çalışan tampon 5 CV (adım 5) sütun yıkayın ve 0.2 M HAC, pH 2.7 ile proteinlerin Zehir. Hassas hedef proteinlerin eluat toplama üzerine Tris-HCl ilavesi ile doğrudan nötralize edilebilir. Kromatografik adımlar MabSelect eluat tersine çevrilirse Sure sütun tampon (adım 3.1) çalışan seyreltilir ve 1 M Tris-HCl ilave edilerek pH yaklaşık 8 artış olabilir. Emin matris ikinci adımı istihdam Genel olarak, dar doruklarına görülmektedir. 4. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile saflık Değerlendirme Yük bir saflaştırılmış fraksiyonlarıeğer istenirse, kütle spektrometresi ile analiz arındırılmış ürün molekül ağırlığı, SDS-PAGE azaltılması ve. ABDz1 ücretsiz bir sistein düşürücü olmayan koşullar altında ürün dimerization neden olabilir bu yana tam örnek azaltmak için önemlidir. 5. Temsilcisi Sonuçlar: Ilkesinin bir kanıtı olarak, dik yakınlık arıtma ABDz1 etiketi ile kolaylaştırdı farklı çözünürlük sınıfları, moleküler ağırlık ve izoelektrik noktaları (Tablo 1) temsil eden üç insan hedef proteinlerin değerlendirildi. ABDz1 gen, genetik, hedef genlerin erimiş ve yapıları E. coli ifade edildi, Şekil 2 ardışık yöntemi tüm adımlar için bir akış şeması gösterir. Dik protokolü tarafından arıtma ardından, farklı noktalarda toplanan numuneler, SDS-PAGE (Şekil 3) ile analiz edildi. Sonuçları bir çift etiket ve iki son derece özel bir arıtma adımları yararını açıkça göstermektedir. Makul bir saflık ac olsa bilehieved jeller görüldüğü gibi ilk arıtma adımdan sonra, ardışık adım de son derece zorlu uygulamalar için uygun, çok saf bir ürün elde edilir. Şekil 1 bispecific ABDz1 etiketi seçimi için kullanılan Kombinatoryal kütüphane tasarımı. 46 amino asit albümin bağlayıcı etki alanı istikrarlı bir üç sarmal paket içine kıvrım ve özellikle ikinci sarmal bulunan insan serum albümin için bağlayıcı bir site içerir. Genetik on birinci ve üçüncü sarmal bulunan yüzey maruz kalan amino asitler rastgele olarak, yeni bir bağlayıcı yüzey mühendisliği oldu. Onbir pozisyonları rakam gösterilir ve Kraulis ve ark göre numaralandırılmıştır. [9 ]. Faj üzerinde ifade Kombinatoryal kütüphanesi ile, bispecific ABDz1 molekül tespit edildi Stafilokokal protein Z etki alanı bir dimer karşı biopanning ardından. <img alt = "Şekil 2" src = "/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg" /> Şekil 2. dik benzeşme arıtma protokolü için basitleştirilmiş akış şeması. ABDz1 dizisi içeren bir PCR-parçası, uygun bir ifade vektör ilgi bir gen ile (N-terminal) bağlandı. Ligasyonu ürün E. dönüştürülmüştür. sıra doğrulama ve plazmid hazırlık için coli. Bir ifadesi ev sahibi dönüşümün ardından, rekombinant protein ekspresyonu için büyük ölçekli bir kültür, bir ilk gecede kültür kurulur. Bakteriler santrifüj yoluyla, hedef protein içeren bakteriyel lizat üretmek için hasat ve sonication tarafından parçalanmış. Artık katı parçacıklar kaldırmak için bir filtrasyon adımdan sonra art arda iki arıtma adımları geçiren lizat bir sıvı taşıma sistemi dik yakınlık arıtma tabi tutulur. Yıkandı, hem de arıtma adımları doruklarına örneklenmiş ve saflık değerlendirmek için SDS-PAGE tarafından değerlendirilir ve t karşılaştırıldığındao arıtma önce lizat. Şekil 3. füzyon ifade ABDz1 ile saflaştırılmış hedef proteinleri SDS-PAGE analizi. Sure-sütun MabSelect tarafından izlenen bir HSA-sütun üzerinde arıtma karşılık gelen doruklarına örnekler, farklı özellikler gösteren ABDz1, ABDz1 Etiketin kendisi için füzyon ifade üç proteinlerin bakteriyel lizat alınan numuneler ile bir araya toplanmıştır (A) . Lanes 1-4 9-12 MabSelect Sure arıtma (ikinci adım) arıtma, HSA arıtma şerit 5-8 (ilk adım) ve şerit önce lizatları örnekler temsil eder. ABDz1-141.377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 ve ABDz1: Örnekler aşağıdaki sırayla yüklenir. (B) yanı sıra, aynı sütun üzerinde tersten saflaştırılmış aynı lizatları elde örnekleri incelendi. Lanes arıtma, şerit 4-6 f önce lizatları örnekleri temsil 1-3rom MabSelect emin arıtma (ilk adım) ve HSA arıtma (ikinci adım) şerit 7-9. Örnekleri (A), ancak etiket kendisi dahil değildir olarak aynı sırayla yüklendi. Bu sonuçlardan yola çıkarak bu iki adımlı bir yöntem adımları sırayla uygulanır bakılmaksızın yüksek derecede saflaştırılmış protein verir açıktır. Adı b Hedef protein Uniprot c Moleküler ağırlık (kDa) Çözünürlük sınıf d Molekül ağırlığı füzyon ürünü (kDa) Izoelektrik nokta füzyon ürün 141377 B7Z315 17,4 4 23,7 8,5 HT875 P01040 10,8 3 17,1 4,9 HT2375 P00740 8,9 5 15,2 6,8 Yalnız ABDz1 etiketi Molekül ağırlığı 6.3 kDa, izoelektrik noktası 6.7. Hedef protein, Uniprot protein bir kısmını temsil eder. http://www.uniprot.org . N-terminal protein parçası Onun 6 ABP 10 Çözünürlüğü sınıfı. Tablo 1. ABDz1 etiketi ile hedef proteinler ve füzyon ürünleri bir ilke çalışmanın bir kanıtı olarak değerlendirilir. Üç farklı molekül ağırlığı, çözünürlük ve izoelektrik noktası eşsiz insan proteinleri dik benzeşme yaklaşımı ile ifade ve saflaştırılması için seçilmiştir.