חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

1. שיבוט של היתוך היעד gene/ABDz1-tagged לבנות הכן שברי PCR של הגן ABDz1 מוקף אתרי הגבלה מתאים קשירת N-מסוף הגן היעד בביטוי פלסמיד (א ABDz1 פלסמיד המכיל זמין באופן חופשי באמצעות הסכם העברת חומר). קליב מטוהרים ביטוי וקטור ושברי PCR עם אנזימי הגבלה נבחר חיץ תגובה הולמת. לטהר את המוצרים לפני קשירת. ולקשור שבר מוגבלת ABDz1 לתוך וקטור ביטוי המכיל את הגן של עניין להפוך את המוצר קשירת ל E. coli (בשיטה המקורית זן RR1ΔM15 שימש 8). מורחים תאים טרנספורמציה על צלחות אגר בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה הבחירה. PCR מסך מושבות אחדות ורצף לאמת את הקלטת הביטוי וכתוצאה מכך על ידי רצפי DNA. הכן פלסמיד מתרבות הלילה של verif רצףהמושבה ied ולהפוך לזן הביטוי המועדף (ב E. coli השיטה המקורית רוזטה (DE3), אירוח pRARE פלסמיד כדי לשפר את הייצור של החלבונים המקודדים על ידי הגנים האנושיים, שימשו). 2. חלבון הביטוי לחסן מושבת חיידקים אחת לתוך 10 מ"ל של מרק סויה tryptic בתוספת תמצית g / l 5 שמרים אנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בסל"ד 150 ב 37 ° C למשך הלילה. לחסן 1 מ"ל של תרבות לילה בינוני 100 מ"ל ו טרי להשרות ביטוי חלבון (במקור 1 mM איזופרופיל-β-D-thiogalactoside כאשר operon החלבי נוצל) כאשר התאים מגיעים לשלב צמיחה לוגריתמי. דגירה בסל"ד 150 במהירות של 25 תאים ° C במשך הלילה הקציר על ידי צנטריפוגה. 3. זיקה אורתוגונלית טיהור Resuspend את הכדור בתוך חיץ 25 מ"ל ריצה (25 מ"מ טריס-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% (w / v) Tween 20, pH 8.0) ולשבש הדואר תאים על ידי sonication ב משרעת 60% ו 1.0/1.0 פולסים דקות 3. צנטריפוגה מדגם ולסנן את חלבון המטרה המכיל supernatant (0.45 מיקרומטר) לפני טיהור נוספים. לאזן בין 1 מ"ל HSA טור Sepharose או עמודה NHS פעילה, יחד בעבר עם HSA על פי המלצות של הספק, עם 10 כרכים עמודה (CV) של הפעלת המאגר ב 1 מ"ל / דקה על מערכת טיהור חלבונים מתאים. טען את lysate חיידקי ב 0.5 מ"ל / דק 'ולאחר מכן לאפס את קצב הזרימה עד 1 מ"ל / דקה. לשטוף את העמודה עם קורות חיים של 5 חיץ רץ ואחריו 5 קורות חיים של חיץ כביסה (5 מ"מ NH 4 Ac, pH 5.5). Elute המדגם עם חיץ elution (0.5 מ 'HAc, pH 2.5) בשעה 1 מ"ל / דקה לאסוף את השברים, הקליטה לפקח על 280 ננומטר לבחור שברים מהפסגה eluted לטיהור נוסף. בריכת שברים עם ריכוז החלבון הגבוהה ביותר, לדלל פעמיים במאגר ריצה בטח (20 פוספט מ"מ, 150 מ"מ NaCl, pH 7.2) ולוודא pH הוא בסביבות נייטרלי. הוסף 1 M טריס-HCl pH 8 להגדיל את ה-pH במידת הצורך. טען את המדגם על 0.5 mL / min על טור 1 HiTrap מ"ל MabSelect בטח כי כבר equilibrated עם קורות חיים של 10 חיץ לרוץ בטח בבית 1 מ"ל / דקה. אפס את קצב הזרימה עד 1 מ"ל / דקה לאחר הטעינה. לשטוף את העמודה עם קורות חיים של 5 חיץ ריצה בטח (שלב 5) ו elute את החלבונים עם 0.2 מ 'HAc, pH 2.7. עבור חלבונים יעד רגיש eluate ניתן לנטרל ישירות על ידי תוספת של טריס-HCl על האוסף. אם הפעולות chromatographic מתהפכים eluate מ MabSelect את הטור בטח יכול להיות מדולל מפעיל המאגר (שלב 3.1) ו-pH עלה ל סביב 8 על ידי תוספת של 1 M טריס-HCl. באופן כללי, פסגות צרה הם נצפו כאשר המטריצה ​​בטח מועסק בשלב השני. 4. הערכת טוהר על ידי אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט ג'ל polyacrylamide (SDS-PAGE) טען את השברים מטוהרים עלהפחתת SDS-PAGE, ואם תרצה, לנתח את משקל מולקולרי של המוצר מטוהרים על ידי ספקטרומטריית מסה. חשוב להפחית באופן מלא את המדגם מאז ציסטאין חופשי ABDz1 עלול לגרום dimerization של המוצר תחת אי – הפחתת התנאים. 5. נציג תוצאות: כהוכחה עקרוני, טיהור זיקה אורתוגונליים בהנחיית תג ABDz1 הוערך במשך שלושה חלבונים היעד האנושי המייצג כיתות מסיסות שונה, משקולות מולקולרית נקודות isoelectric (טבלה 1). הגן היה ABDz1 התמזגו גנטית הגנים היעד המבנים התבטאו החיידק, תרשים 2 מציג תרשים זרימה של כל השלבים השיטה ברציפות. לאחר טיהור ידי פרוטוקול אורתוגונליים, דגימות שנאספו בנקודות שונות נותחו על ידי SDS-PAGE (איור 3). התוצאות מראות בבירור את התועלת של תג כפולה בשני שלבים לטיהור מאוד ספציפיות. למרות טוהר סבירה achieved לאחר שלב הטיהור הראשוני כפי שניתן לראות מן הג'לים, הצעד רצופים התשואות מוצר טהור מאוד גם מתאים מאוד יישומים תובעניים. באיור 1. עיצוב הספרייה קומבינטורית המשמש מבחר של תג ABDz1 bispecific. 46 אמינו אלבומין מחייב חומצה תחום מתקפל לחבילה של שלושה יציב הסליל והוא מכיל אתר קשירה עבור אלבומין בסרום האדם נמצא בעיקר הסליל השני. עד גנטית אקראי eleven משטח חשוף חומצות אמיניות הממוקם הסליל הראשון והשלישי, משטח מחייב הרומן תוכנן. באחת עשרה תפקידים מצוינים באיור ממוספרות לפי Kraulis et al. 9. בעקבות biopanning נגד דימר של תחום-Z של חלבון staphylococcal עם הספרייה קומבינטורית הביע על הפאג, את המולקולה bispecific ABDz1 זוהה. <iמ"ג alt = "איור 2" src = "/ files/ftp_upload/3370/3370fig2.jpg" /> באיור 2. תרשים זרימה פשוט עבור פרוטוקול זיקה אורתוגונליים טיהור. PCR-קטע המכיל את רצף ABDz1 הוא ligated (N-סופני) עם הגן של עניין וקטור ביטוי מתאים. המוצר קשירת הופך ל E. coli לאימות רצף והכנת פלסמיד. בעקבות השינוי לארח ביטוי, תרבות בקנה מידה גדול עבור ביטוי חלבון רקומביננטי מוגדר מתרבות לילה ראשונית. חיידקים נקצרים על ידי צנטריפוגה ו lysed ידי sonication לייצר lysate בקטריאלי המכיל את חלבון המטרה. לאחר שלב הסינון כדי להסיר חלקיקים מוצקים שיורית, lysate הוא נתון טיהור זיקה אורתוגונליים על מערכת טיפול הנוזל על ידי עובר שני צעדים טיהור ברציפות. פסגות eluted משני השלבים לטיהור נדגמים הוערכו על ידי SDS-PAGE כדי להעריך את טוהר לעומת tהוא lysate לפני הטיהור. באיור 3. SDS-PAGE ניתוח של חלבונים היעד הביע וטיהר ב היתוך עם ABDz1. דגימות שנלקחו lysate החיידק של שלושה חלבונים ביטוי היתוך ABDz1, המייצגים תכונות שונות, ואת תג ABDz1 עצמה נאספו יחד עם דגימות הפסגות המתאימה טיהור על עמודה HSA ואחריו MabSelect בטוחה עמודה (A) . Lanes 1-4 מייצגים דגימות lysates לפני, נתיבי טיהור 5-8 מתוך טיהור HSA (השלב ​​הראשון) ואת נתיבי 9-12 מתוך טיהור MabSelect בטח (השלב ​​השני). דוגמאות נטענים, לפי הסדר הבא: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 ו ABDz1. בנוסף, רכשה דגימות מן lysates אותו מטוהרים בסדר הפוך על עמודות זהה נותחו (B). Lanes 1-3 מייצגים דגימות lysates לפני, נתיבי טיהור 4-6 וrom MabSelect טיהור בטוחה (השלב ​​הראשון) ואת הסמטאות 7-9 מתוך טיהור HSA (השלב ​​השני). דוגמאות הועמסו באותו סדר כמו ב (א) אלא את תג עצמו אינו כלול. מתוך תוצאות אלה ברור כי בשיטה זו שני שלבים התשואות חלבונים מטוהרים ללא סדר הפעולות מוחלים. שם ב יעד חלבון Uniprot ג מולקולרית משקל (KDA) מסיסות בכיתה ד מולקולרית משקל המוצר של היתוך (KDA) Isoelectric נקודה המוצר היתוך 141377 B7Z315 17.4 4 23.7 8.5 HT875 P01040 10.8 3 17.1 4.9 HT2375 P00740 8.9 5 15.2 6.8 משקל מולקולרי של תג ABDz1 לבדו הוא 6.3 kDa, הצבע isoelectric 6.7. חלבון מטרה מייצג חלק של החלבון Uniprot. http://www.uniprot.org . מסיסות מעמד של שבר חלבון עם N-ABP מסוף 6 שלו 10. טבלה 1. חלבונים יעד ומוצרי היתוך עם תג ABDz1 להעריך הוכחה במחקר העיקרון. שלושה חלבונים אנושיים ייחודיים עם משקל מולקולרי מסיסות שונה, נקודת isoelectric נבחרו ביטוי וטיהור על ידי הגישה את הזיקה אורתוגונליים.