A raíz de la celda de destino en<em> E. coli</em> Después de la infección por fagos Lambda

1. Creación de un lisado de fago cruda (Figura 1) En un matraz de 50 ml, se inocula una colonia fresca de LE392 (λ LZ1) [pPLate * D] (véase la Tabla 1 para detalles) en 6 ml de medio LB suplementado con 10 7 ug / ml de kanamicina y 100 mg / ml de ampicilina. Crecer durante la noche a 30 ° C con agitación suave (180 rpm). Diluir la cultura 1:100 en LBM (LB suplementado con 10 mM MgSO 4) y crecen a 30 ° C con agitación suave (180 rpm). Con el fin de optimizar el rendimiento del fago, asegurarse de que el volumen de cultivo no es más que una décima parte de la capacidad de volumen del matraz. Nos típicamente preparar dos matraces de 2 litros de capacidad o 2,5 litros, y añadir 2,5 ml de cultivo durante la noche en medio LBM 250 ml en cada matraz. Cuando la densidad celular alcanza OD 600 ≈ 0,6 (~ 2,5 a 3 h), se provoca el lisógeno moviendo el cultivo a 42 ° C un baño de agua agitador durante 18 min con agitación suave (180 rpm) y, a continuación incue a 37 ° C con agitación suave (180 rpm) hasta que la lisis es visible (cultivo se vuelve clara, en ~ 60 – 90 min). Añadir 2% de cloroformo a la cultura, agitar para mezclar a mano, y luego se incuba durante 15 min a temperatura ambiente. Precaución: Use guantes para manejar el cloroformo, y evite respirar el mismo. Transferencia de la cultura en dos botellas de 250 ml de centrífuga, centrifugar el cultivo en un rotor Sorvall GSA a 10.000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Recuperar el sobrenadante que contiene las partículas de fago, y desechar el residuo de restos. Realizar una segunda centrifugación para asegurarse de deshacerse de los restos visibles. Utilizar un protocolo de fagos de titulación estándar 8 para medir la concentración de fagos. El título de fago debe ser ~ 5-10 x 10 9 ufp / ml. Usar una cepa supF tal como LE392 como la cepa indicadora debido a la mutación SAM7 en el genotipo del fago fluorescente, y el uso de agar superior y placas de agar hechas con NZYM rica para obtener grandes placas (Figura 2). 2. Fago purificación (Figura 1) Verter el lisado en una grande (por ejemplo 2-litros) matraz, añadir DNasa I y RNasa (1 mg / ml cada uno) para el lisado con el fin de digerir los ácidos nucleicos liberados de las bacterias lisadas, y se incuba 1 hora a temperatura ambiente. Añadir NaCl 1 M al lisado, transferir el lisado en botellas de 250 ml de centrífuga, y se incuba 3 horas en hielo. Se centrifuga el lisado en un Sorvall GSA a 10.000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Recuperar el sobrenadante. El título de fago debe ser similar a la del lisado crudo, que es ~ 5-10 x 10 9 ufp / ml. La adición de NaCl promueve la disociación de partículas de fago a partir de restos de bacterias y se requiere para la precipitación eficaz de partículas de fago por PEG 8. Verter el lisado en un matraz grande, por ejemplo 2-litros matraz, añadir 10% (w / v) de PEG8000 en el lisado, lentamente revolver o agitar para disolver PEG8000 a temperatura ambiente. Transferir el lisado en 250 ml cientorifuge botellas y luego incubar durante la noche (~ 16 h) a 4 ° C. Se centrifuga el lisado en un rotor Sorvall GSA a 10.000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. Remojar el sedimento (partículas de fago se precipitó con PEG8000) con el fago tampón SM (4 ml de tampón SM por 250 ml de lisado de fago inicial). Incubar con agitación muy suave o sin agitación durante 16 horas a 4 ° C. Suavemente llevar a cabo el lisado (tampón SM con las partículas de fago) en un tubo de 50 ml de centrífuga Eppendorf, y luego lavar el sedimento remanente con 0,5 – 1 ml de tampón SM. Añadir un volumen igual de cloroformo al lisado. Mezclar suavemente el lisado con cloroformo hasta inversora y hacia abajo por un par de veces. Centrifugar a 4.000 rpm durante 15 min a 4 ° C en un Eppendorf 5804R o una centrífuga de sobremesa similares. Repita el paso 2.6 para obtener un lisado claro. El título de fago debe ser ~ 1-2 x 10 11 pfu / ml. Preparar SM / CsCl soluciones con tres densidades diferentes (ρ) de 1,3 g / ml, 1.5 G / ml y 1,7 g / ml. Medir el índice de refracción (η) para obtener una lectura de densidad más precisa. La conversión de densidad ρ = 9 es η 10,8601 – 13,4974 a 25 ° C. Ver Tabla 3 para obtener más información. Usar una jeringa con una aguja larga para cargar la solución en un 14 ml ultra-claro tubo de ultracentrífuga Beckman 40Ti. Para evitar la mezcla y para formar un gradiente de densidad mejor, como fondo para la solución (es decir, soluciones de capas de densidad creciente debajo de la otra) se debe utilizar, es decir, suavemente cargar 2 ml de SM / CsCl soluciones en el orden de 1,3 g / ml, 1,5 g / ml y 1,7 g / ml mediante la inserción de la aguja con una jeringa de 3 ml a la parte inferior del tubo. Suavemente cargar 8 ml de lisado de fago mediante la superposición de la parte superior del tubo de ultracentrífuga de 14 ml. Preparar un tubo de equilibrio. Se centrifuga en un rotor Beckman SW40Ti a 24.000 rpm durante 4 horas a 4 ° C. Con suavidad fuera del tubo en una habitación oscura y iluminar desde la parte superior del tubo contra un fondo negro usando aflashlight. La banda del fago debe ser claramente visible en la ubicación de la interfaz entre 1,3 g / ml y 1,5 g / ml SM / CsCl capas (Figura 3A). Punción a través de la pared del tubo ligeramente por debajo de la banda con una aguja de calibre 21,5 con una jeringa de 3 ml. Suavemente recoger ~ 500 l de la suspensión de fagos. El título de fago debe ser ~ 5-10 x 10 11 pfu / ml. Coloque la suspensión de fagos en un 4 ml ultra-claro ultracentrífuga Beckman SW60Ti tubo rotor. Llenar el tubo con 1,5 g / ml SM / solución de CsCl. Preparar un tubo de equilibrio. Se centrifuga en un rotor Beckman SW60Ti a 35.000 rpm durante 24 horas a 4 ° C. Repetir el mismo procedimiento que en el Paso 2,11 para recoger el fago de la banda visible. La banda debe ser visible como se muestra en la Figura 3B. Cargar la suspensión de fago en un cassette de membrana de diálisis (Tabla 2) y se dializa tres veces contra un volumen de 1000-veces mayor de tampón SM a 4 º C durante una duración de 3 hr, 3 hr y Overnight (~ 16 h). El propósito de la diálisis es deshacerse de CsCl presente en la suspensión de fago. El título de fago final debe ser ~ 5-10 x 10 11 pfu / ml. 3. Preparar una placa de gel de agarosa (Figura 4) Limpiar 6 portaobjetos de microscopio (75 x 50 mm, 1 mm de espesor) con 70% de etanol. Organizar 5 diapositivas y sujetarlo con cinta como se muestra en la Figura 4. Mezclar 0,09 g de agarosa en medio de 6 ml en un pequeño vaso de precipitados cubierto con film transparente (lo que da 1,5% de agarosa). Calentar en una placa calefactora hasta que la solución se vuelva transparente. Vierta la solución de agarosa en las diapositivas garantizados. Coloque la última diapositiva en la parte superior, evitando burbujas de aire. Coloque el peso en la parte superior y deje que se enfríe durante ~ 30 min. Retire los 4 diapositivas en el lado, y envolver la losa junto con las diapositivas superior e inferior con film transparente. La losa se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de 3 días. 4. Prueba del stock de fago purificado Prepararun gel de agarosa al PBS-losa tal como se describe anteriormente (Sección 3). Manchar el fago purificado con DAPI. Mezclar 10 l de fago (~ 1 x 10 10 pfu / ml) con 10 l de 10 mg / ml DAPI (concentración final DAPI de 5 ug / ml), incubar durante 30 min a 4 ° C o 10 min a temperatura ambiente. Place 1 l de la mezcla fago / DAPI en el centro de una No.1 24 x 50 mm cubreobjetos, se superponen a una pieza pequeña (~ 10 x 10 mm) de la pre-preparado PBS-agarosa. El pequeño trozo de placa de agarosa se corta con una cuchilla de afeitar después de la corredera superior en el gel sándwich se retira. Imagen de la muestra bajo el microscopio de epifluorescencia a través de los canales de YFP y DAPI. Fagos individuales deben ser visible como limitadas por difracción fluorescentes "puntos" en ambos canales (Figura 5). Utilice el mismo microscopio y configuraciones de cámara como en el paso 6.2. 5. Infección (Figura 6) En un tubo de 14 ml Falcon, inocular una colonia fresca de LE392 [pp RE-MCHerry] (véase la Tabla 1 para detalles) en 2 ml de medio LB suplementado con 100 mg / ml de ampicilina, 10 mM MgSO 4 y 0,2% de maltosa. Crecer durante la noche a 37 ° C con agitación moderada (265 rpm). Diluir la cultura 1:1000 en LBMM (LB suplementado con 10 mM MgSO 4 y 0,2% de maltosa), es decir, añadir 5 l cultivo de una noche en 5 ml de medio LBMM en un matraz de 50 ml. Crecer a OD 600 ≈ 0,4 a 37 ° C con agitación moderada (265 rpm). Use el medio LBM para preparar una losa de gel de agarosa LBM-tal como se describe en la Sección 3. Centrifugar 1 ml de células a 2.000 g en una microcentrífuga de sobremesa durante 2 minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente las células en 20 l de hielo frío LBMM para llegar a OD 600 y 20. Al manipular el stock de fago purificado, utilizar una pipeta de punta ancha o cortar la punta de la pipeta regular para hacer la punta de la apertura más amplia, para evitar esquilar las partículas de fago 3. Suavemente Mix 20 l de células con 20 l de fago purificado hasta alcanzar una media fagos a célula relación en el intervalo de 0,1 a 5. Incubar en hielo durante 30 min para permitir la adsorción del fago, y luego incubar en un baño de agua 35 ° C durante 5 min para activar la inyección del ADN del fago 6. Pipetear hacia arriba y abajo varias veces para separar las agregados de células. Una vez más utilizar una pipeta de punta ancha para evitar el cizallamiento de los fagos. Diluir la mezcla en 1:10 LBMM, por ejemplo 5 a 45 l mezcla LBMM l. Coloque un pedazo de losa LBM-agarosa (~ 10 x 10 mm) sobre un cubreobjetos No.1 22 mm x 22. El pre-preparado de agarosa LBM-losa debe ser colocado a temperatura ambiente durante al menos 1 hora antes de su uso para asegurarse de que la losa de agarosa alcanza la temperatura ambiente. Place 1 l de la mezcla fago / células en la losa de agarosa y esperar durante 1 minuto para permitir la mezcla para absorber en la losa de agarosa. Coloque suavemente una No.1 24 x 50 mm cubreobjetos en la parte superior de la losa de agarosa. Este procedimiento se pretende evitar cizallar los fagos de la infeja celular (Figura 6). 6. Después de destino de la célula en el microscopio Monte con cuidado el cubreobjetos sobre la platina del microscopio. Para las imágenes, usar un objetivo de gran aumento (por ejemplo, 100x) (véase el sistema de microscopio en adelante). Adquirir una imagen fijada para el período de tiempo inicial. Este conjunto de imágenes se utiliza para caracterizar los números iniciales y las posiciones de todos los fagos que infectan. Tome una serie de 15 imágenes a 200 nm eje Z (vertical) intervalos. Imagen través del canal de YFP. Además, tomar una sola imagen que tiene el foco a través del contraste de fase y canales mCherry. Optimizar la intensidad de la luz y el tiempo de exposición para obtener una señal suficiente mientras se minimiza la decoloración y el daño celular (ver Adquisición de imágenes en discusión más adelante). Adquirir una película de lapso de tiempo del destino celular después de la infección. Imagen de la muestra, de contraste de fase y YFP mCherrycanales a intervalos de tiempo de 10 min por alrededor de 4 horas. Durante la película de lapso de tiempo, utilizar un único z-posición de la imagen por canal, por punto de tiempo, para evitar la exposición innecesaria de la muestra, lo que podría conducir a la decoloración y la fototoxicidad. 7. Análisis de la imagen Manualmente contar el número de fagos y anote la localización de fagos y la longitud de la célula en el período de tiempo inicial. Esto se puede hacer usando software tal como MetaMorph o ImageJ. Registre los destinos celulares (lítico, lisogénico o no infectada), el tiempo de lisis, y cualquier otra información deseada a reproducir la película de lapso de tiempo. Para identificar los diferentes destinos celulares, vea Time-lapse películas en la sección Resultados Representante a continuación. Además del análisis manual anteriormente, la información más cuantitativa (por ejemplo, nivel de fluorescencia con el tiempo en las células individuales) se puede extraer utilizando automatizados de reconocimiento de células linaje y algoritmos de búsqueda. Utilizamos una casa construida programa Matlab para tracing el linaje de células y los niveles de fluorescencia, junto con el código Schnitzcell Matlab para la segmentación celular (escrito por el grupo Elowitz en Caltech). 8. Los resultados representativos: Fago Plating: Las placas de los fagos marcados con fluorescencia (en 1,6 y en la sección Paso 2) son significativamente más pequeños que los de tipo salvaje (Figura 2). Por lo tanto, se incuban las placas de al menos 12 horas en 37 ° C incubadora para las placas a ser visible. Fago Ultracentrifugación: Después de la ultracentrifugación de la muestra de fagos con el gradiente escalonado de CsCl (paso 2,10), dos bandas deben ser visibles (Figura 3A). La banda superior, en la interfaz entre la suspensión de fago y SM / CsCl 1,3 capa g / ml, contiene restos de células y cápsidas vacías de fagos. La banda inferior, en la interfaz entre SM / CsCl 1,3 g / ml y 1,5 capas g / ml, es la banda de fagos. This banda aparece verdosa fluorescente para el fago λ LZ2. La banda de tipo salvaje fago λ IG2903 aparece azulado 5. Después de la ultracentrifugación en gradiente de equilibrio de CsCl en el paso 2,12, una banda de fago debe ser visible en la parte media del tubo (Figura 3B). Dado que el fago λ LZ2 fluorescente contiene una mezcla de GPD-EYFP y GPD cápsidas, la relación de proteína a ADN es mayor que la de tipo salvaje. Por lo tanto, la banda de la fluorescente fago λ LZ2 es ligeramente más claro (parece estar en un lugar más alto en el tubo) que el de tipo salvaje λ IG290310. Tinción DAPI: La Figura 5 muestra imágenes típicas obtenidas después de marcar el fago con DAPI (Sección 4). Los YFP y DAPI señales de un fago purificado con éxito debe tener cerca de 100% correspondencia. Nos típicamente observar que menos del 1% de la mancha YFPs no contienen DAPI (representando cápsidas sin el genoma viral). Menos del 1% de los puntos DAPI no contienen YFP (correspondiente a los fagos no fluorescentes) 5. Time-lapse película: Células líticas son reconocidos por la acumulación de YFP fluorescencia (canal verde) dentro de la célula, seguido por la lisis celular. Células lisogénicas son reconocidos por la acumulación de fluorescencia uniforme mCherry (rojo) en el interior de la célula y la reanudación del crecimiento celular normal y división. Las células no infectadas (o células donde la infección no ha funcionado) no presenta ninguna de los fenotipos anteriores y crecen y se dividen normalmente. Figura 7 muestra unas pocas imágenes-conjuntos de contraste de fase, YFP y canales mCherry, y las imágenes correspondientes superpuestas de estos tres canales, de una típica película de lapso de tiempo (Sección 6). Los fagos individuales (manchas verdes) son claramente visibles en el marco de tiempo inicial (Figura 7A). Normalmente, un númerofagos de se ven en la superficie celular (presumiblemente infectar dichas células), mientras que otros fagos son no adsorbido, como se muestra en la Figura 7B (panel izquierdo). El resultado se convierte en infección distinguible en el tiempo. El ciclo lítico se indica mediante la producción intracelular de nuevos fagos (verde, Figura 7C), seguido por la lisis celular (células explotaron con fagos liberados verdes, Figura 7D). Lisogenia se indica mediante la producción de mCherry a partir del promotor P RE (rojo, Figura 7C) y la reanudación del crecimiento y división celular (rojo, Figura 7D). Figura 1. </strong> Diagrama de flujo que describe la creación de fagos fluorescentes. Un lisado de fago crudo que se obtenga mediante la inducción de un lisógeno del fago GPD-EYFP, que alberga un plásmido que expresa la proteína de tipo salvaje grupo D (paneles AB). El fago se purificó a través de una serie de pasos (CL paneles). Figura 2. Placas de fago. Las placas de los fagos fluorescente (a la izquierda) son más pequeños que los de tipo salvaje (a la derecha) después de incubar las placas durante 12 horas a 37 ° C. Figura 3. Bandas de fagos después de la ultracentrifugación. A) Dos bandas son visibles después de la ultracentrifugación en un gradiente escalonado de CsCl. La de arriba corresponde a los restos celulares y cápsides vacías de fagos, y la banda inferior contiene el fago deseado. Izquierda: fago fluorescente, derecha:. Tipo silvestre B ) Una banda de fago solo es visible después de la ultracentrifugación en un gradiente de equilibrio de CsCl. La banda fago fluorescente (a la izquierda) es de color verdoso, en comparación con una banda azul de fago de tipo salvaje (derecha). Figura 4. El procedimiento de preparación de placas de gel de agarosa. Figura 5. Imágenes fluorescentes de fagos después de la tinción DAPI. Fagos individuales son fácilmente distinguibles, y YFP y DAPI señales co-localizar muy bien. Figura 6. Descripción esquemática de la infección por fagos y la configuración de imagen. Haga clic aquí para ver una versión en tamaño completo de la imagen. gura 7 "src =" / files/ftp_upload/3363/3363fig7.jpg "/> Figura 7. Imágenes típicas de una película de lapso de tiempo de la infección por fagos. Se muestra el contraste de fase, YFP y canales mCherry, así como una superposición de los tres canales. (A) YFP canales imágenes de la período de tiempo inicial. Izquierda, la suma de las imágenes en diferentes YFP z posiciones. Las tres imágenes de la derecha son imágenes de muestra YFP en diferentes z posiciones, correspondientes a las diferentes áreas de la superficie de la célula. (B), (C) y (D) las imágenes superpuestas (izquierda) de la fase de contraste (centro-izquierda), YFP (centro-derecha) y mCherry (derecha) canales en distintos marcos temporales. (B) En t = 0, dos células se ven, cada infectada por un fago solo (manchas verdes), y una célula es infectada por 3 fagos. También se observan algunos fagos adsorbidos. (C) En t = 80 min, las dos células infectadas por fagos individuales han seguido cada una en la vía lítica, como indicand por la producción intracelular de nuevos fagos (verde). La célula infectada por 3 fagos ha entrado en la vía lisogénica, como se indica por la producción de mCherry a partir del promotor PRE (rojo). (D) En t = 2 h, la vía lítica ha dado lugar a la lisis celular (células de despiece), mientras que la célula lisogénica ha dividido §. § Paneles izquierdo de la Figura 7 (C) y (D) son extraídas de la célula, 141, Lanying Zeng, Samuel O. Skinner, Zong Chenghang, Sippy Jean, Feiss Michael, y Golding Ido, toma de decisiones a nivel subcelular determina el resultado de la infección por bacteriófagos, 682-691, Copyright (2010), con permiso de Elsevier. Colar nombre Genotipo relevantes Fuente / referencia Cepas bacterianas LE392 cenarF John Cronan, Universidad de Illinois Cepas de fagos λ LZ1 GPD-EYFP, cI857 SAM7 D-EYFP b :: kanR Zeng et al. 5 λ LZ2 GPD-mosaico, mismo genotipo que λ LZ1 Zeng et al. 5 Los plásmidos pP RE – mCherry mCherry bajo el control de P RE, R amp Zeng et al. 5 pPLate * D grupo D bajo el control del promotor λ tarde, amp R Zeng et al. 5 Tabla 1. Cepas bacterianas,fagos y plásmidos utilizados en este trabajo. Densidad ρ (g / ml) CsCl (g) SM (ml) Indice de refracción η 1,30 39 86 1,3625 1,50 67 82 1,3815 1,70 95 75 1,3990 Tabla 3. Soluciones de CsCl preparada en tampón SM (100 ml) para gradientes escalonados.