Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

Siehe Abbildung 1 für eine Illustration der Zusammenfassung der folgenden Protokoll. Sicherheitshinweis: Alle Materialien, die in Kontakt mit montiertem viralen Partikel wurde muss mit Virkon Lösung oder einem anderen geeigneten Desinfektionsmittel desinfiziert werden. 1. Herstellung von Plasmid-DNA Aktien (~ 2 Tage) Die folgenden Plasmide sind 1 erforderlich: PRV1 – mit dem AAV2 Rep und Cap-Sequenzen PH21 – mit dem AAV1 Rep und Cap-Sequenzen pFdelta6 – Adenovirus-Helfer-Plasmid AAV-Plasmid enthaltend das rekombinante Expressionskassette AAV2 Verpackung Signale (inverted terminal repeats, ITR) flankiert Während pFdelta6 in Stbl2 kompetente Zellen gezüchtet werden sollten, um partielle Deletion zu verhindern, können PRV1 und PH21 in DH5alpha kompetente Zellen gezüchtet werden. AAV-Plasmiden können in Stbl2 Zellen gezüchtet werden, wenn partielle Deletionen in DH5alpha Zellen vorkommen. Plasmid-DNA von hoher Qualität und frei von RNA Verunreinigungen sein. Plasmide können für Integrität mit folgenden Übersichten zu sehen sein: PRV1 – Verdau mit XbaI zu geben Bands von 7,5 kb und 3,8 kb PH21 – Verdau mit EcoRI Bands von 4,5 kb, 2,8 kb und 0,2 kb geben pFdelta6 – Verdau mit HindIII Bands von 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb und 1,5 kb geben 2. Vorbereitung von humanen embryonalen Nierenzellen 293 (HEK293) Zellen zur Transfektion (2 bis 3 Tage) Platte zwei 80% konfluente 150 cm 2 Flaschen HEK293-Zellen in fünf 15 cm Durchmesser Nunc Gewebekulturschalen. Die Zellen sind 70 – 80% konfluent vor der Transfektion (etwa 48 Stunden nach dem Ausplattieren). Kultur-Zellen in Standard-Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit niedrigen Glukose mit 10% fötalem Kälberserum und 100 U / ml Penicillin / 100 ug / ml Streptomycin. 3 Stunden vor der Transfektion entfernen DMEM und ersetzen mit Iscove'S modifiziertes Dulbecco Medium (IMDM) mit 5% fötalem Kälberserum. 3. Die Transfektion der viralen Plasmiden (~ 1 Stunde für die Transfektion, 3 Tage Inkubation) Bereiten Sie die folgenden für eine einzelne Charge (5 x 15 cm Zellkulturplatten) des Virus: 62,5 pg AAV-Plasmid 125 &mgr; g pFdelta6 31,25 pg PRV1 31,25 pg PH21 1650 ul 2,5 M CaCl 2 12 ml dH 2 O In der Klasse 2 Gewebekultur Haube Sterilfilter die Transfektion Mischung in eine 50 ml Tube. Während Vortexen der Lösung schnell hinzufügen 13 ml 2 x HEPES-gepufferter Salzlösung (pH 7,05). Ersetzen Deckel 50 ml Tube und weiter Wirbel für 15 Sekunden. Lassen Sie für 1 Minute 45 Sekunden stehen, sollten sich ein feiner weißer Niederschlag bilden. Vorsichtig mit 5 ml der Transfektion Lösung für jede 15 cm Gewebe Kulturschale. Swirl Platten zu mischen und zum Inkubator. 16 Stunden nach der Transfektion entfernen IMDM-Medium und ersetzen mit DMEM. 4. Lyse der Zellen und die Ernte von rAAVs (2 Stunden) 72 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie Medien aus Zellkultur-Platten und entsorgen. Alle Abfälle sollten mit Virkon Lösung oder einem anderen geeigneten Desinfektionsmittel behandelt werden. Vorsichtig waschen die Zellen in warmem 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4). 25 ml warmem PBS zu jeder Platte und entfernen Sie vorsichtig Zellen mit einem Zellschaber. Sammeln Suspension in 50 ml Tuben. Pellet-Zellen bei 800 xg für 10 Minuten. Überstand verwerfen und Pellet in 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, verwenden Sie 10 ml pro Gewebekulturplatte. Aufgeteilt in zwei 50 ml-Tuben. Bereiten Sie eine frische Lösung von 10% Natriumdeoxycholat in dH 2 O. Add 1,25 ml dieser zu jedem Röhrchen für eine Endkonzentration von 0,5%. Add Benzonase Nuklease um eine Endkonzentration von 50 Einheiten pro Milliliter. Mix Rohr gründlich. <li> bei 37 ° C für 1 Stunde. Entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 3000 xg für 15 Minuten. Transfer zum frischen 50 ml Tube, sicherzustellen, dass alle Zelltrümmer entfernt wurde, um zu verhindern Sperrung von Heparin-Säulen (siehe Schritt 5). In diesem Stadium können die Proben bei -20 ° C, bevor Sie fortfahren werden. Wir haben Proben für mehrere Wochen bei -20 ° C ohne eine Reduktion der Infektiosität gespeichert. 5. Heparin Säule Reinigung von rAAVs (2 bis 3 Stunden) Setup-HiTrap Heparin-Spalten mit einer Schlauchpumpe, so dass Lösungen fließen durch die Säule mit 1 ml pro Minute für Schritte von 5,2 bis 5,4. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Heparin-Säule eingeführt werden. Äquilibrieren der Säule mit 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Übernehmen 50 ml Virus-Lösung in die Spalte und lassen ungehindert durchfließen. Wash Säule mit 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. Mit einem 5-ml-Spritze weiterhin die Spalte w waschenit 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, mit 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, gefolgt. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Mit 5 ml Spritzen und sanften Druck eluieren das Virus aus der Säule durch die Anwendung: 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 Sammeln Sie diese in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. 6. Konzentration und Sterilfiltration von rAAVs (1 Stunde) Konzentrieren Vektor mit Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter Einheiten mit einem 100.000 Molekulargewichtsschnitt. Legen Sie 4 ml Eluat in den Konzentrator und Zentrifuge bei 2000 xg für 2 Minuten (bei Raumtemperatur). Discard Durchfluss und reload-Konzentrator mit den restlichen Virus-Lösung und wiederholen Zentrifugation. Die konzentrierte Volumen sollte ca. 250 ul werden. Wenn konzentrierte Volumen ist deutlich mehr als diese, verwerfen den Fluss turch und weiterhin in 1 Minute Schritte Zentrifuge bis beläuft sich auf rund 250 ul. Add 250 ul PBS, um Viren zu einem Endvolumen von 500 ul und entfernen von Konzentrator. Filter-Vektor durch eine 13 mm Durchmesser 0,2 &mgr; Spritzenfilter. Vector sollten aliquotiert und bei -80 ° C gelagert werden, bis sie benötigt. 7. Titrierung von viralen Aktien (3 Tage) Dies erfordert ein Promotor, der aktiv in HEK293-Zellen Fahren ein Reporter-Gen oder ein immuncytochemisch nachweisbar Genprodukt ist. Bei der Herstellung eines Vektors, die nicht kompatibel mit HEK293-Zellen anderer Zelllinien oder primäre Zellkulturen verwendet werden kann. Bereiten 18 Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen oder 18 Vertiefungen Nunc Kammer gleitet durch Impfen HEK293-Zellen, so dass sie 40 sind – 50% konfluent. Für die Titration von Cre-abhängigen rAAVs Verwendung HEK293-Zellen, die stabil exprimieren die Cre-Rekombinase 2. Infect jede Vertiefung mit serieller dilutions des AAV-Vektors (Abb. 2A). Verwenden Sie 3 Vertiefungen pro Verdünnung. Wir routinemäßig add Virus direkt in jede Vertiefung. Nach 72 Stunden fix HEK293-Zellen durch Zugabe des gleichen Volumens von 4% Paraformaldehyd (PFA) bis mittel (was eine Endkonzentration von 2% PFA) für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wash Zelle dreimal in PBS, in dH 2 O und Deckglas spülen. Zählen Sie die Anzahl der transduzierten Zellen aus den drei Brunnen, die den höchsten Verdünnungsfaktor haben, aber immer noch enthalten infizierten Zellen, den Durchschnitt dieser und multiplizieren mit dem Verdünnungsfaktor, um die Anzahl der infektiösen Einheiten pro Mikroliter (Abb. 2B) zu geben. 8. Erwartete Ergebnisse HEK293-Zellen transduziert mit einem Virus kodiert Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) in Abbildung 2B dargestellt sind. Wir in der Regel eine konsistente Titer von etwa 6 x 10 6 infektiöse Partikel pro Mikroliter. Wir verwenden routinemäßig diese Vektoren für stereotaktische injektion in die Erwachsenenwelt Nagetier Gehirn. Dies bietet eine leistungsstarke Technik für Region-spezifische Genexpression 2. Um diese Region Spezifität mit Zell-Typ selektive Genexpression spritzen wir die Rekombinase Cre-abhängigen rAAVs in Zielregionen der Cre-transgenen Mäusen 2 kombinieren. Abbildung 2C-E zeigt Beispiele für stereotaktische Injektion von Cre-abhängigen rAAVs Kodierung eGFP in verschiedenen Hirnregionen der Erwachsenenbildung Parvalbumin-Cre transgenen Mäusen 3. Abbildung 1. Schematische Darstellung des Protokolls für rAAV Produktion. . 1) HEK293-Zellen sind vernickelt und wuchs auf 70 bis 80% Konfluenz. 2). AAV und Helferplasmide sind bereit und in HEK293-Zellen transfiziert. 3). Medium ist wieder DMEM 16 Stunden nach der Transfektion verändert und HEK293-Zellen sind für weitere 56 Stunden kultiviert. 4). HEK293-Zellen werden geerntet und lysiert. rAAV-Vektoren sind aus Zelltrümmer durch c getrenntentrifugation. 5). Virale Partikel werden durch Heparin Spalten vor Konzentration und Sterilisation gereinigt. 6). HEK293-Zellen werden auf 24-Well-Platten gewachsen und infizieren mit seriellen Verdünnungen des AAV-Vektors auf die Anzahl der infektiösen Einheiten zu bestimmen. Abbildung 2. Titrierung und in vivo Anwendung der rAAV1 / 2. (A) Setup von HEK293-Zellen für die Messung virale Titer. HEK293-Zellen mit seriellen Verdünnungen von rAAVs transduziert. C, nicht infizierten Kontrolle; N, 1 ul unverdünnter virale Lager. (B) HEK293-Zellen mit rAAVs Ausdruck eGFP infiziert. (CE) Viral eGFP-Expression beschränkt sich auf Cre-exprimierenden Neuronen in verschiedenen Zielregionen Parvalbumin-Cre transgenen Mäusen nach stereotaktische Injektion von Cre-activated rAAVs. Beispiele Bilder zeigen GFP-Immunreaktivität in (C) der retikulären Thalamus und Globus pallidus (D) Gyrus dentatus und (E) der CA1 Region des Hippocampus. DG, dentate Gyrus; RT, retikuläre Thalamuskern; GP, globus pallidus. Maßstabsbalken: B, 500 pm, C, 100 pm, D, 100 pm, E, 500 um.