Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

Voir Figure 1 pour une illustration résumant le protocole suivant. Note de sécurité: Tous les documents qui ont été en contact avec les particules virales assemblées doit être désinfecté avec une solution Virkon ou un autre désinfectant approprié. 1. Préparation des stocks d'ADN plasmidique (~ 2 jours) Les plasmides suivants sont requis 1: pRV1 – Contenant de la Rep AAV2 et des séquences Cap PH21 – Contenant de la Rep AAV1 et des séquences Cap pFdelta6 – Adenovirus-plasmide helper Plasmide AAV contenant la cassette d'expression recombinante flanqué AAV2 signaux d'emballage (répétitions terminales inversées, RTI) Bien pFdelta6 doivent être cultivées dans Stbl2 cellules compétentes pour empêcher la suppression partielle, pRV1 et PH21 peuvent être cultivés dans des cellules DH5alpha compétentes. Plasmides AAV peuvent être cultivés dans des cellules Stbl2 si délétions partielles se produisent dans les cellules DH5alpha. L'ADN plasmidique devrait être de haute qualité et exempts de contaminants ARN. Les plasmides peuvent être sélectionnés pour l'intégrité en utilisant les suivantes digère: pRV1 – digérer par Xbal pour donner des bandes de 7,5 kb et 3,8 kb PH21 – digérer par EcoRI pour donner des bandes de 4,5 kb, 2,8 kb et 0,2 kb pFdelta6 – digérer avec HindIII pour donner des bandes de 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb et 1,5 kb 2. Préparation de l'Homme cellules rénales 293 (HEK293) embryonnaires pour la transfection (2 – 3 jours) Deux plaques de 80% confluentes de 150 cm 2 flacons de cellules HEK293 en cinq plats 15 cm de diamètre de culture de tissus Nunc. Les cellules doivent être de 70 à 80% de confluence avant la transfection (environ 48 heures après placage). Cellules en culture en milieu standard Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec faible taux de glucose contenant 10% de sérum de veau foetal et 100 U / ml de pénicilline / 100 pg / ml de streptomycine. 3 heures avant la transfection retirer DMEM et le remplacer par Iscove«Moyen s de Dulbecco modifié (IMDM) contenant 5% de sérum de veau foetal. 3. La transfection de plasmides viraux (~ 1 heure pour la transfection, 3 jours d'incubation) Préparer les informations suivantes pour un seul lot (5 x 15 cm des plaques de culture de tissu) du virus: 62,5 ug de plasmide AAV 125 ug pFdelta6 31,25 mg pRV1 31,25 mg PH21 1650 ul de 2,5 M CaCl 2 12 ml dH 2 O Dans une classe de filtre 2 capot de culture de tissus stériles le mélange de transfection dans un tube de 50 ml. Alors vortex de la solution, ajouter rapidement 13 ml de HEPES x 2 saline tamponnée (pH 7,05). Replacer le couvercle du tube de 50 ml et de continuer à vortex pendant 15 secondes. Laisser reposer pendant 1 minute 45 secondes, un fin précipité blanc doit se former. Doucement ajouter 5 ml de la solution de transfection pour chaque plat de 15 cm de culture de tissu. Swirl plaques pour mélanger et retourner à l'incubateur. 16 heures après transfection retirer milieu IMDM et remplacer par du DMEM. 4. Lyse des cellules et la récolte de rAAVs (2 heures) 72 heures après transfection, retirez le support de plaques de culture cellulaire et le jeter. Tous les déchets doivent être traités avec une solution Virkon ou un autre désinfectant approprié. Lavez délicatement les cellules de phosphate de 1x chaude saline tamponnée (PBS, pH 7,4). Ajouter 25 ml de PBS chaude à chaque plaque et retirez délicatement les cellules avec un racleur de cellules. Recueillir suspension dans des tubes de 50 ml. Pellet cellules à 800 xg pendant 10 minutes. Rejeter le surnageant et remettre le culot dans 150 mM de NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, utiliser 10 ml par plaque de culture tissulaire. Scindé en deux tubes de 50 ml. Préparer une nouvelle solution de désoxycholate de sodium à 10% en DH 2 O. Ajouter 1,25 ml de cette dans chaque tube pour une concentration finale de 0,5%. Ajouter benzonase nucléase à une concentration finale de 50 unités par ml. Mélanger soigneusement le tube. <li> Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Enlevez les débris cellulaires par centrifugation à 3000 xg pendant 15 minutes. Transfert à tube de 50 ml frais, s'assurer que tous les débris cellulaires a été enlevée pour empêcher le blocage des colonnes d'héparine (voir étape 5). A ce stade, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C avant de continuer. Nous avons stocké des échantillons pendant plusieurs semaines à -20 ° C sans réduction de l'infectiosité. 5. Purification sur colonne d'héparine de rAAVs (2 – 3 heures) Configuration des colonnes HiTrap héparine en utilisant une pompe péristaltique afin que les solutions de flux dans la colonne à 1 ml par minute pour les étapes 5.2 à 5.4. Il est important de s'assurer qu'aucune bulle d'air sont introduits dans la colonne d'héparine. Equilibrer la colonne avec 10 ml de NaCl 150 mM, Tris 20 mM, pH 8,0. Appliquer 50 ml solution de virus de la colonne et permettre de circuler à travers. Laver la colonne avec 20 ml de NaCl 100 mM, Tris 20 mM, pH 8,0. En utilisant une seringue de 5 ml de continuer à laver les colonnes wvec 1 ml de NaCl 200 mM, Tris 20 mM, pH 8,0, puis 1 ml de NaCl 300 mM, Tris 20 mM, pH 8,0. Jeter l'effluent à travers. Utiliser seringues de 5 ml et éluer une légère pression du virus de la colonne en appliquant: 1,5 ml de NaCl 400 mM, Tris 20 mM, pH 8,0 3,0 ml de NaCl 450 mM, Tris 20 mM, pH 8,0 1,5 ml de NaCl 500 mM, Tris 20 mM, pH 8,0 Collectionnez ces dans un tube à centrifuger de 15 ml. 6. Concentration et la filtration stérile de rAAVs (1 heure) Concentré vecteur en utilisant Amicon ultra-4 unités de filtration centrifuge avec une coupure 100 000 poids moléculaire. Charge de 4 ml d'éluat de la colonne dans le concentrateur et centrifuger à 2000 xg pendant 2 minutes (à température ambiante). Jeter accréditives et le concentrateur de rechargement avec une solution de virus restants et centrifugation répéter. Le volume concentré devrait être d'environ 250 pi. Si le volume de concentré est beaucoup plus que cela, jeter le flux de trâce et de continuer à centrifugeuse dans une minute jusqu'à ce que les mesures de volume est d'environ 250 pi. Ajouter 250 pi de PBS au virus pour un volume final de 500 pl et retirer du concentrateur. Filtrer à travers un vecteur de diamètre filtre de 0,2 um 13 mm seringue. Vecteur devraient être aliquotés et conservés à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire. 7. Titrage des stocks viraux (3 jours) Cela nécessite un promoteur qui est actif dans les cellules HEK293 conduire un gène rapporteur ou un produit du gène immunocytochimique détectable. Lorsque la production d'un vecteur qui n'est pas compatible avec les cellules HEK293 autres lignées cellulaires ou des cultures de cellules primaires peut être utilisé. Préparer 18 poly-L-lysine lamelles de verre enduit ou 18 puits de diapositives chambre de Nunc par ensemencement des cellules HEK293 de sorte qu'ils sont 40 – 50% confluentes. Pour le titrage de Cre dépendant rAAVs utiliser les cellules HEK293 qui expriment de façon stable la recombinase Cre 2. Infect chaque puits avec de série Dilutions du vecteur AAV (figure 2A). Utilisez 3 puits par dilution. Nous avons régulièrement ajouter des virus directement à chaque puits. Après 72 heures corriger les cellules HEK293 en ajoutant un volume égal de 4% de paraformaldéhyde (PFA) à moyenne (ce qui donne une concentration finale de 2% PFA) pendant dix minutes à température ambiante. Laver la cellule à trois reprises dans du PBS, rincer à l'dH 2 O et lamelle. Comptez le nombre de cellules transduites par les trois puits qui ont le plus haut facteur de dilution, mais contient encore des cellules infectées, trouver le moyen de ces derniers et le multiplier par le facteur de dilution de donner le nombre d'unités infectieuses par microlitre (figure 2B). 8. Résultats prévus HEK293 transduites avec un encodage virus renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) sont présentés dans la figure 2B. Nous avons généralement d'atteindre des titres cohérents d'environ 6 x 10 6 particules infectieuses par litre micro. Nous utilisons régulièrement ces vecteurs pour stéréotaxique Injection dans le cerveau de rongeurs adultes. Ceci fournit une technique puissante pour la région spécifique l'expression des gènes 2. Pour combiner cette spécificité région avec un type de cellule d'expression génique sélective nous injectons de la recombinase Cre dépendant rAAVs dans les régions cibles de Cre-souris transgéniques 2. Figure 2C-E montre des exemples d'injections stéréotaxiques de Cre dépendant rAAVs encodage eGFP dans différentes régions du cerveau des souris adultes parvalbumine-Cre transgéniques 3. Figure 1. Illustration schématique du protocole pour la production de rAAV. . 1) les cellules HEK293 sont plaquées et cultivées à 70 – 80% de confluence. 2.) Plasmides AAV et d'aide sont préparés et transfecté dans les cellules HEK293. 3.) Medium est modifié pour revenir à DMEM 16 heures après transfection et les cellules HEK293 sont cultivées pour un autre 56 heures. 4.) HEK293 sont récoltées et lysées. vecteurs rAAV sont séparés des débris cellulaires par centrifugation. 5.) Les particules virales sont purifiées à travers des colonnes d'héparine avant la concentration et la stérilisation. 6.) HEK293 sont cultivés sur des plaques de 24 puits et les infecter avec des dilutions en série du vecteur AAV pour déterminer le nombre d'unités infectieuses. Figure 2. Titrage et en application in vivo de rAAV1 / 2. (A) l'installation des cellules HEK293 pour la mesure de titre viral. Cellules HEK293 sont transduites avec des dilutions en série de rAAVs. C, le contrôle non infectés, N, 1 pl de stock viral non dilué. (B) Hek293 cellules infectées par rAAVs exprimant eGFP. (CE) expression de l'EGFP virale est limitée à Cre-neurones exprimant dans les régions cibles différentes de souris transgéniques parvalbumine-Cre après l'injection stéréotaxique de Cre-activé rAAVs. Des exemples montrent des images immunoréactivité GFP dans (C) pallidus l'réticulaire du thalamus et le globus, (D) le gyrus denté et (E) de la région CA1 de l'hippocampe. DG, deNtate gyrus; RT, le noyau réticulaire thalamique; GP, le globus pallidus. Barres d'échelle: B, 500 um; C, 100 um; D, 100 um; E, 500 um.